模擬失重條件下microRNA-494抑制成骨細(xì)胞分化作用機(jī)制的研究.pdf

1、空間長(zhǎng)期重力環(huán)境的改變會(huì)引起機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的變化，包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫系統(tǒng)功能不全、心血管系統(tǒng)適應(yīng)性減弱等。通過(guò)物理訓(xùn)練和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充等措施的實(shí)施可以緩解肌肉萎縮、提高心血管系統(tǒng)的適應(yīng)性，然而，目前尚沒(méi)有辦法對(duì)抗微重力引起的宇航員骨質(zhì)流失，這是威脅長(zhǎng)期進(jìn)行太空工作宇航員身體健康的最主要因素之一。微重力導(dǎo)致骨質(zhì)流失速度大約為每月減少2％的骨礦物質(zhì)密度，相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女一年流失的骨量。研究表明，重力和機(jī)械負(fù)荷是保持骨骼完整性的重要因素，然

2、而微重力環(huán)境引起骨質(zhì)丟失的機(jī)制尚不完全清楚。已有的研究顯示，失重引起的骨量減少是因?yàn)楣切纬膳c重吸收之間的平衡被破壞，骨質(zhì)形成減少，而重吸收保持正?；蛟黾樱罱K導(dǎo)致了骨量丟失。由于成骨細(xì)胞分化是骨骼形成和維持骨量的關(guān)鍵步驟，所以目前被普遍接受的觀點(diǎn)認(rèn)為微重力導(dǎo)致的骨丟失的主要原因是成骨的細(xì)胞分化障礙，但是導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化障礙的分子機(jī)制并不完全清楚。
　　miRNA是一類長(zhǎng)度約18-25nt的小分子RNA，存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種

3、有機(jī)生命內(nèi)。miRNA通過(guò)完全或不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合于靶基因的mRNA的3’UTR，負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。大約超過(guò)30％的基因表達(dá)都受到miRNA的調(diào)控，表明miRNA調(diào)控基因表達(dá)這一現(xiàn)象是普遍存在的。miRNA在細(xì)胞增殖、分化、死亡等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。許多研究認(rèn)為，miRNA參與了對(duì)成骨細(xì)胞成骨過(guò)程的表達(dá)調(diào)控，是成骨細(xì)胞分化的重要的調(diào)節(jié)分子。
　　本研究中我們以BMP-2誘導(dǎo)小鼠間充質(zhì)多能前體細(xì)胞C2C12成骨分化為研究對(duì)

4、象，探討模擬失重狀態(tài)下，成骨細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的改變，進(jìn)而研究miRNA在失重性骨丟失中的作用及其分子機(jī)制。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下：
　　1.微重力抑制成骨細(xì)胞分化和成熟。我們首先在細(xì)胞水平上檢測(cè)微重力對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。我們將C2C12細(xì)胞置于回轉(zhuǎn)器培養(yǎng)，同時(shí)加入300ng/mlBMP-2誘導(dǎo)分化，對(duì)照組不加BMP-2刺激。72小時(shí)后，Real-timePCR檢測(cè)成骨細(xì)胞特異基因堿性磷酸酶（Alkalineph

5、osphatase，ALP）,骨鈣素（osteocalcin，OC）,骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和Runx2，結(jié)果顯示，在模擬失重環(huán)境下，成骨細(xì)胞分化受到顯著抑制。成骨細(xì)胞分化過(guò)程有多條通路參與，我們檢測(cè)了微重力對(duì)部分通路相關(guān)分子表達(dá)的影響。我們按上述方法處理C2C12細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞裂解液，Westernblot結(jié)果顯示，微重力引起B(yǎng)MPR2、FGFR2、Runx2的蛋白表達(dá)降低。尾部懸吊能夠消除大鼠后

6、肢機(jī)械負(fù)荷，是研究模擬失重的良好動(dòng)物模型。本研究中我們采用核素骨掃描檢測(cè)了懸吊大鼠骨質(zhì)形成。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組大鼠相比懸吊大鼠骨和關(guān)節(jié)中99mTc-MDP的聚集明顯減少，而且差異隨懸吊時(shí)間延長(zhǎng)而增大。該結(jié)果說(shuō)明，微重力引起骨代謝減弱，骨生成減少。
　　2.微重力環(huán)境可以引起成骨細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的改變。我們將C2C12細(xì)胞置于回轉(zhuǎn)器中模擬失重培養(yǎng)，模擬失重培養(yǎng)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞均加入BMP-2誘導(dǎo)其向成骨方向分化。72小時(shí)后，收集細(xì)

7、胞提取總RNA并進(jìn)行miRNA芯片檢測(cè)。miRNA芯片篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)了７個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有2個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA有5個(gè)。Real-timePCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，其中mmu-miR-494模擬失重后表達(dá)水平明顯升高，mmu-miR-18*,mmu-miR-122a,mmu-miR-301,andmmu-miR-340表達(dá)水平則顯著降低，但mmu-miR-143的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差別。

8、生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)表達(dá)上調(diào)的miR-494的靶基因參與成骨細(xì)胞分化，因此我們將關(guān)注的焦點(diǎn)放在對(duì)miR-494的研究上。給予BMP-2處理的C2C12細(xì)胞在模擬失重0、2、4、8、12、24、48和72小時(shí)后分別收集細(xì)胞檢測(cè)miR-494表達(dá)水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)，在模擬失重2小時(shí)，miR-494表達(dá)開(kāi)始上升，并且隨著失重時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-494表達(dá)持續(xù)升高。此外，我們分離了懸吊大鼠股骨近側(cè)干垢端成骨細(xì)胞，檢測(cè)其中miR-494表達(dá)水平，

9、發(fā)現(xiàn)懸吊2周和４周的大鼠其成骨細(xì)胞內(nèi)miR-494表達(dá)均明顯上調(diào)，并隨懸吊時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)升高。該實(shí)驗(yàn)表明微重力環(huán)境能引起成骨細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的改變，其中mmu-miR-494的升高十分顯著，且其表達(dá)水平與模擬失重的時(shí)間正相關(guān)。
　　3.miR-494抑制成骨細(xì)胞分化。為了驗(yàn)證miR-494對(duì)骨形成的作用，我們首先檢測(cè)miR-494對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。我們將miR-494mimics及其相應(yīng)陰性對(duì)照（N.C.）轉(zhuǎn)染C2

10、C12細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，miR-494對(duì)細(xì)胞增殖和周期無(wú)明顯影響。進(jìn)一步的研究顯示，在BMP-2存在時(shí)，miR-494能明顯抑細(xì)胞ALP活性，但未給予BMP-2刺激時(shí)，這種抑制效果不顯著，表明miR-494可能參與了對(duì)C2C12細(xì)胞成骨分化的抑制。隨后，我們用Reai-timePCR、ELISA和WesternBlot分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)了miR-494對(duì)成骨細(xì)胞特異基因ALP、

11、OC、OPG、Runx2表達(dá)的影響。與ALP染色和活性測(cè)定結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染miR-494后細(xì)胞中ALPmRNA表達(dá)降低，而且無(wú)論是否存在BMP-2，OC、OPG和Runx2表達(dá)也有所下降。ELIAS分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-494減少了細(xì)胞分泌OC和OPG。在BMP-2誘導(dǎo)下，Runx2蛋白表達(dá)上調(diào)，但是轉(zhuǎn)染miR-494后Runx2的上調(diào)被抑制。Osx是Runx2下游基因，我們發(fā)現(xiàn)在BMP-2誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-4

12、94抑制了Osx的表達(dá)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-494后，其成肌分化的相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，而miR-494對(duì)C2C12細(xì)胞成脂分化無(wú)明顯作用。我們的研究表明，miR-494能抑制細(xì)胞的成骨分化。
　　4.miR-494通過(guò)調(diào)節(jié)Runx2、BMPR2和FGFR2的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞分化。我們用生物信息學(xué)方法在包括miRanda、TargetScan、pictar和RNAhybriddatabases等在內(nèi)的

13、多個(gè)網(wǎng)站進(jìn)行miR-494靶基因預(yù)測(cè)，得到可能的靶基因超過(guò)1,000個(gè)。我們進(jìn)一步從中篩選出參與成骨細(xì)胞分化的靶基因30個(gè)，并將這些基因3’UTR克隆入熒光素酶報(bào)告載體，與miR-494mimics或N.C.共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，檢測(cè)其相對(duì)熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-494能顯著抑制BMPR2、FGFR2和Runx23’UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，且抑制效率達(dá)到40-60％。相反地，突變掉這些基因上miR-494的結(jié)合位點(diǎn)后，miR-4

14、94對(duì)熒光素酶活性的影響消失，表明miR-494可以結(jié)合并作用于上述基因的3’UTR。WesternBlot和Real-timePCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-494明顯抑制內(nèi)源性BMPR2、FGFR2和Runx2的蛋白和mRNA表達(dá)。為了進(jìn)一步確定miR-494是通過(guò)抑制BMPR2、FGFR2和Runx2的表達(dá)影響成骨細(xì)胞分化，我們合成了針對(duì)這3個(gè)基因的siRNA。將3種siRNA分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞72小時(shí)，成骨細(xì)胞特異基因表達(dá)下調(diào)

15、，骨分化受抑制，其趨勢(shì)與轉(zhuǎn)染miR-494一致。我們的研究證明，miR-494通過(guò)直接下調(diào)和Runx2、BMPR2和FGFR2抑制成骨細(xì)胞的分化。
　　5.轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對(duì)miR-494的表達(dá)調(diào)控。為了探討miR-494轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們對(duì)miR-494上游序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果顯示，距離pre-miR-4945’端2-3kb的上游序列在不同種屬中有高度的保守性，提示這段序列可能參與了對(duì)miR-494的轉(zhuǎn)錄

16、調(diào)控。進(jìn)一步的分析表明該區(qū)域有多個(gè)Myod的結(jié)合位點(diǎn)，提示轉(zhuǎn)錄因子Myod可能參與了miR-494的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們首先分析了模擬失重時(shí)，BMP-2誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中Myod表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著失重時(shí)間的延長(zhǎng)，Myod表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，這與miR-494表達(dá)變化相一致。隨后，我們?cè)谡Ｖ亓l件下培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞中加入BMP-2，研究細(xì)胞分化過(guò)程中mi-494與Myod表達(dá)變化情況，Real-timePCR結(jié)果顯示兩者表達(dá)水平隨誘導(dǎo)

17、時(shí)間的延長(zhǎng)同時(shí)下降。此外，我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-494后，MyoD的表達(dá)水平也發(fā)生了上調(diào)。我們的研究初步顯示了轉(zhuǎn)錄因子MyoD可能參與了對(duì)miR-494的表達(dá)調(diào)控。為了證實(shí)我們的推測(cè)，進(jìn)一步的的相關(guān)實(shí)驗(yàn)還在深入進(jìn)行中。
　　6.miR-494inhibitor能夠部分緩解失重引起的成骨分化障礙。模擬失重時(shí)成骨細(xì)胞分化受抑制，miR-494表達(dá)升高。我們將針對(duì)miR-494的反義寡核苷酸，即miR-494inhibitor及其相應(yīng)對(duì)

18、照N.C.inhibitor分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，同時(shí)加入300ng/mlBMP-2誘導(dǎo)分化，置于回轉(zhuǎn)器模擬失重培養(yǎng)72小時(shí)，用Real-timePCR方法檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-494的表達(dá)能夠使ALP染色增強(qiáng)，說(shuō)明miR-494inhibitor能夠增加骨形成能力，部分緩解失重引起的成骨分化障礙。
　　總之，我們發(fā)現(xiàn)miRNA參與失重性成骨細(xì)胞功能異常的發(fā)生。其中，我們對(duì)表達(dá)上調(diào)的miR-494功能和作用機(jī)