microRNA-34c在調(diào)控成骨細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 MicroRNA-34c/PI3K-Akt調(diào)控環(huán)路在Vaspin調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化中的作用機(jī)制研究
　　背景:
　　骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的疾病，它主要表現(xiàn)為骨量降低和骨細(xì)微結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重者可導(dǎo)致骨折發(fā)生。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，OP在我國人群中的發(fā)病率大約為13.2％，其治療及預(yù)防費(fèi)用給國家和社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，因此研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制及影響因素具有非常重要的意義。脂肪因

2、子是一類由脂肪細(xì)胞分泌的活性生物分子，包括脂聯(lián)素、瘦素、網(wǎng)膜素等多個成員。研究發(fā)現(xiàn)多個脂肪因子在骨代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，其中內(nèi)臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，以往的研究發(fā)現(xiàn)它可以抑制人成骨細(xì)胞的凋亡，但是對于Vaspin在成骨分化過程中的作用尚未見報道。
　　目的:
　　本實驗旨在研究Vaspin對小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系成骨分化的影響，并觀察miR-34c在此過程

3、中的作用，從而探討Vaspin調(diào)控成骨分化的具體機(jī)制。進(jìn)一步，研究PI3K-Akt信號通路在此過程中的激活并討論其與miR-34c之間的相互作用，有助于完整闡明Vaspin調(diào)控成骨分化的機(jī)制，為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供新的靶點。
　　方法:
　　1.分別使用不同濃度的Vaspin干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞72小時或聯(lián)合β-甘油磷酸鈉(β-GP)干預(yù)20天，通過對硝基苯酚法、western blot及放免法等方法檢測成骨相關(guān)標(biāo)志

4、物的表達(dá)變化，以明確Vaspin對MC3T3-E1成骨分化的影響;
　　2.通過microarray技術(shù)分析Vaspin干預(yù)前后MC3T3-E1microRNA(miRNA)表達(dá)譜的改變，篩選可能參與了此過程的miRNA;
　　3.通過查閱成骨分化相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合第2步結(jié)果篩選可能參與了此過程的miRNA，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證芯片結(jié)果;
　　4.通過向MC3T3-E1內(nèi)轉(zhuǎn)染mimics或者inhi

5、bitor構(gòu)建miRNA過表達(dá)或低表達(dá)模型，檢測在這兩種模型中Vaspin對成骨分化的影響，以進(jìn)一步證實miRNA的表達(dá)變化是Vaspin調(diào)控MC3T3-E1成骨分化的可能機(jī)制;
　　5.在前人研究的基礎(chǔ)上對miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，通過向MC3T3-E1內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA mimics或者inhibitor構(gòu)建過表達(dá)或者低表達(dá)模型，檢測靶基因mRNA及蛋白變化以證實猜測;
　　6.采用western blot檢測Vaspi

6、n干預(yù)MC3T3-E1各個時間點間磷酸化Akt(p-Akt)的表達(dá)變化來研究PI3K-Akt信號通路在Vaspin調(diào)控MC3T3-E1成骨分化中的變化;
　　7.利用LY294002預(yù)處理細(xì)胞阻斷PI3K-Akt信號通路后給予Vaspin干預(yù)，通過qRT-PCR檢測miRNA表達(dá)，以研究PI3K-Akt信號通路在此過程中對miRNA表達(dá)的調(diào)控作用;
　　8.利用PI3K-Akt阻斷劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞阻斷PI3K-A

7、kt信號通路，通過觀察阻斷后Vaspin對MC3T3-E1成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確PI3K-Akt信號通路在此過程中的作用;
　　9.利用miRNA mimics或者inhibitor構(gòu)建miRNA過表達(dá)或低表達(dá)模型，給予模型Vaspin干預(yù)，通過western bolt觀察p-Akt蛋白表達(dá)情況以明確miRNA對PI3K-Akt信號通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.MC3T3-E1經(jīng)過不同濃度的Vaspi

8、n干預(yù)72小時后，與對照組相比，干預(yù)組Runx2蛋白的表達(dá)下降、ALP活性降低、OC分泌減少，且下降呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。用100ng/ml的Vaspin干預(yù)β-GP誘導(dǎo)分化的MC3T3-E1細(xì)胞20天，礦化結(jié)節(jié)形成顯著降低;
　　2.Microarray分析結(jié)果提示我們在Vaspin抑制MC3T3-E1成骨分化的過程中mmu-miR-127，mmu-miR-34c，mmu-miR-214，mmu-miR-139,mmu-miR-63

9、50,mmu-miR-30a, mmu-miR-146b,mmu-miR-483的表達(dá)上調(diào)，同時mmu-miR-210，mmu-miR-31，mmu-miR-6380, mmu-miR-126, mmu-miR-218-1, mmu-miR-720,mmu-miR-379，mmu-miR-2861表達(dá)下調(diào)。結(jié)合文獻(xiàn)篩選miR-34c作為本實驗的主要研究對象，qRT-PCR結(jié)果證實Vaspin干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞后，miR-34c表達(dá)

10、水平明顯升高;
　　3.向MC3T3-E1內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-34c inhibitor可以降低miR-34c的表達(dá)，低表達(dá)模型構(gòu)建成功;Vaspin干預(yù)低表達(dá)模型后我們發(fā)現(xiàn)Vaspin的成骨抑制作用減弱;
　　4.低表達(dá)miR-34c可以增強(qiáng)Runx2蛋白表達(dá)，但Runx2 mRNA無明顯變化;過表達(dá)miR-34c可以抑制Runx2蛋白表達(dá)，同樣的Runx2mRNA無明顯變化;結(jié)合前人的研究證實Runx2是miR-34c的靶基因

11、;
　　5.Western blot結(jié)果顯示Vaspin可以刺激MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi) p-Akt表達(dá)，在給予Vaspin后5分鐘即有p-Akt表達(dá)，15分鐘表達(dá)達(dá)到峰值;
　　6.LY294002可以阻斷p-Akt表達(dá);LY294002預(yù)處理MC3T3-E1后給予Vaspin干預(yù)，qRT-PCR結(jié)果顯示LY294002可以阻斷Vaspin對miR-34c表達(dá)的促進(jìn)作用;
　　7.給予LY294002預(yù)處理MC3T3-

12、E1，加入Vaspin干預(yù)后發(fā)現(xiàn)LY294002可以減弱Vaspin的成骨抑制作用;
　　8.MC3T3-E1轉(zhuǎn)染miR-34c inhibitor后給予Vaspin干預(yù)，westernblot顯示p-Akt表達(dá)較對照組增加，c-met蛋白表達(dá)增加，c-met mRNA無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.Vaspin可以抑制MC3T3-E1的成骨分化，且該抑制作用具有劑量依賴效應(yīng);
　　2.miR-34c表達(dá)升高是

13、Vaspin抑制MC3T3-E1成骨分化的可能機(jī)制;
　　3.miR-34c與PI3K-Akt信號通路相互作用組成了一個調(diào)控環(huán)路共同參與了Vaspin對MC3T3-E1成骨分化的調(diào)控。
　　第二部分 MicroRNA-34c在間充質(zhì)干細(xì)胞自發(fā)成骨分化過程中的作用機(jī)制研究
　　背景:
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一類具有自我更新以及多向分化潛能的原始細(xì)胞，是體內(nèi)成骨細(xì)胞的主要來源，它的增殖及成骨分化對于維持成骨

14、細(xì)胞的數(shù)量具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，骨髓內(nèi)的MSC數(shù)量逐漸減少并伴有細(xì)胞狀態(tài)的老化，同時也有研究發(fā)現(xiàn)MSC在老化過程中會發(fā)生自發(fā)的成骨分化，其具體機(jī)制目前尚不明確。MiR-34c是一類在干細(xì)胞分化及骨代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的miRNA，所以我們推測miR-34c的表達(dá)變化是MSC自發(fā)成骨分化的可能機(jī)制之一。
　　目的:
　　檢測在人MSC自發(fā)成骨分化過程中miR-34c的表達(dá)變化其及啟動子區(qū)甲基化程度的變化，

15、探索miR-34c在MSC自發(fā)成骨分化過程中的作用及調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　通過多次傳代構(gòu)建老化MSC模型，通過對硝基苯酚法、放免法及western blot檢測MSC在自發(fā)老化的過程中ALP活性、OC分泌以及Runx2蛋白的表達(dá)變化，明確在MSC老化過程中其成骨能力的改變;用qRT-PCR檢測miR-34c的表達(dá)變化，Lipo2000轉(zhuǎn)染miR-34cmimics/inhibitor構(gòu)建miR-34c過表達(dá)/低表達(dá)模型

16、，通過研究自發(fā)分化中miR-34c的表達(dá)變化以及不同表達(dá)狀態(tài)miR-34c對成骨分化的影響，從而證實miR-34c參與了MSC老化過程中成骨能力變化的調(diào)控。通過亞硫酸鹽測序(BSP)，檢測miR-34c啟動子區(qū)的甲基化程度及qRT-PCR檢測DNMTs的表達(dá)，研究甲基化在miR-34c表達(dá)水平中的調(diào)控作用;用5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)分別干預(yù)老化的MSC3天及6天，抽提細(xì)胞總RNA，用qRT-PCR檢測miR-34c，D

17、NMTsmRNA的表達(dá)變化證實甲基化是miR-34c表達(dá)變化的可能機(jī)制之一。
　　結(jié)果:
　　1.我們成功分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并構(gòu)建了體外擴(kuò)增模型;
　　2.經(jīng)過流式細(xì)胞儀及分化誘導(dǎo)后染色，結(jié)果證實所分離細(xì)胞表達(dá)MSC特異性表面分子且具有雙向分化潛能;
　　3.隨著傳代次數(shù)的增加，MSC中Runx2蛋白表達(dá)上調(diào)、ALP活性增加、OC分泌增多，提示MSC在老化過程中會發(fā)生自發(fā)的成骨分化;
　　4.隨著傳代次

18、數(shù)的增加，miR-34c的表達(dá)下降，使用Lipo2000轉(zhuǎn)染miR-34c mimics構(gòu)建過表達(dá)模型，MSC中ALP活性降低、OC分泌減少、Runx2蛋白表達(dá)下調(diào)，但Runx2 mRNA表達(dá)無明顯變化，結(jié)合前人的研究成果我們推測miR-34c通過調(diào)控Runx2的變化參與了MSC的自發(fā)成骨分化;
　　5.亞硫酸鹽測序證實在多次傳代過程中miR-34c啟動子區(qū)甲基化程度上調(diào);
　　6.隨著傳代次數(shù)的增加，DNMT1 mRNA表

19、達(dá)明顯上調(diào)，DNMT3A及DNMT3B mRNA表達(dá)無明顯變化，提示我們DNMT1表達(dá)升高是miR-34c啟動子區(qū)甲基化程度增加的可能機(jī)制;
　　7.5-Aza-dC干預(yù)老化MSC后DNMT1 mRNA表達(dá)下調(diào)，miR-34c表達(dá)上調(diào)，證實DNMT1介導(dǎo)的啟動子區(qū)甲基化是miR-34c在MSC自發(fā)成骨分化中表達(dá)下降的可能機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　miR-34c啟動子區(qū)甲基化程度增加所致的miR-34c表達(dá)下調(diào)是骨髓間充質(zhì)