Semaphorin 3A對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目前，牙槽骨缺損或骨量不足的患者，尤其是伴有2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus,T2DM）等骨代謝障礙的患者，種植體骨結(jié)合差、種植修復(fù)失敗率高的問題已引起廣泛關(guān)注。利用干細(xì)胞通過骨組織工程技術(shù)解決骨代謝障礙患者牙槽骨缺損問題、促進(jìn)其種植體骨結(jié)合是近年來的研究熱點(diǎn)。其中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）以其來源豐富、易獲取、不受倫理學(xué)制約等得天獨(dú)厚的優(yōu)點(diǎn)而成為該領(lǐng)

2、域的“明星干細(xì)胞”。但有研究表明，受其固有屬性影響， ADSCs傾向于成脂分化而成骨分化能力較弱。因此，提高ADSCs成骨分化能力是解決上述問題的關(guān)鍵。腦信號(hào)蛋白Semaphorin3A（Sema3A）參與并正向調(diào)控骨代謝平衡，能促進(jìn)成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞（如ADSCs）成骨，是一種極具應(yīng)用前景的骨保護(hù)因子。本研究利用Sema3A重組蛋白處理小鼠ADSCs，重點(diǎn)觀察Sema3A促進(jìn)ADSCs成骨分化的時(shí)間效應(yīng)，并通過相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)分析Not

3、ch信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用，以期探明Sema3A促進(jìn)ADSCs成骨分化的可能機(jī)制，為其最終用于臨床工作、改善上述患者群種植體骨結(jié)合狀況提供科學(xué)研究基礎(chǔ)。
　　目的及意義：
　　通過觀察Sema3A對(duì)ADSCs成骨分化的促進(jìn)作用及其時(shí)間作用模式，并借助Notch信號(hào)通路特異性阻斷劑γ-分泌酶抑制劑（Gamma-secretase inhibitor,GSI）分析Notch信號(hào)通路在其中所扮演的角色，探索Sema3A促進(jìn)ADS

4、Cs成骨分化的可能機(jī)制，為其在口腔種植領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.Ⅰ型膠原酶消化法分離、培養(yǎng)C57BL/6小鼠ADSCs，并通過形態(tài)學(xué)觀察、多向分化誘導(dǎo)和表面分子標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2.利用qPCR，Western Blot和免疫熒光染色等方法，觀察Sema3A及其受體Nrp1（Neuropilin-1）在ADSCs成骨分化過程中的表達(dá)變化；利用qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因、茜素

5、紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成、ALP染色檢測(cè)ALP活性等方法，觀察Sema3A對(duì)ADSCs成骨的促進(jìn)作用，重點(diǎn)關(guān)注其時(shí)間作用模式以及Sema3A對(duì)ADSCs干性的改變和成骨分化的啟動(dòng)作用。
　　3.用GSI阻斷Notch信號(hào)通路后，通過qPCR和Western Blot檢測(cè)其對(duì)ADSCs干性的影響；利用qPCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子在ADSCs成骨分化過程中的變化趨勢(shì)，并通過qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因以及ALP染色檢測(cè)ALP活性、天

6、狼星紅染色檢測(cè)膠原分泌、茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成等方法觀察GSI作用下成骨誘導(dǎo)7，14和21d時(shí)的成骨效果。以qPCR和免疫熒光染色的方法觀察Sema3A重組蛋白作用下，ADSCs對(duì)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的變化。成骨誘導(dǎo)過程中，聯(lián)合應(yīng)用Sema3A重組蛋白與GSI，觀察成骨效果。
　　結(jié)果：
　　1.成功獲得具有多向分化潛能的ADSCs。
　　2.ADSCs本身及其成骨分化全過程中均表達(dá)Sema3A及其受體Nr

7、p1，且Sema3A在成骨初期表達(dá)明顯上調(diào)，之后逐漸降低、于成骨末期恢復(fù)到初始水平；而Nrp1表達(dá)水平始終保持恒定。Sema3A重組蛋白能促進(jìn)ADSCs的成骨分化，且Sema3A作用時(shí)間越長(zhǎng)、作用階段越早，作用效果越明顯。Sema3A能直接降低ADSCs干性、啟動(dòng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的ADSCs成骨分化。
　　3.GSI阻斷ADSCs中Notch信號(hào)通路后，ADSCs中干性相關(guān)基因表達(dá)降低。ADSCs中表達(dá)的Notch信號(hào)通路相關(guān)分子主要

8、有Notch2，Jagged2，Hes1；ADSCs成骨分化早期，上述各分子表達(dá)明顯下調(diào)。在ADSCs成骨分化早期用GSI處理7d可以增強(qiáng)ADSCs成骨分化，延長(zhǎng)處理時(shí)間至14-21d則抑制ADSCs成骨分化。
　　4.Sema3A重組蛋白可以降低ADSCs對(duì)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)；同單獨(dú)應(yīng)用Sema3A或GSI處理相比，成骨初期同時(shí)用Sema3A重組蛋白和GSI進(jìn)行干預(yù)，不能進(jìn)一步促進(jìn)ADSCs成骨分化。
　　結(jié)