miR-22對(duì)人脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞成脂成骨分化的調(diào)控作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)作為一類具有多向分化潛能的細(xì)胞群體，在一定誘導(dǎo)條件下可以進(jìn)行成脂分化或成骨分化。由于起源于同一細(xì)胞，MSCs的成脂分化和成骨分化又是一個(gè)相互抑制的過程。大量研究己分別對(duì)MSCs的成脂分化或成骨分化機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)地探討，然而關(guān)于MSCs成脂成骨分化的雙向調(diào)控研究仍然太少。一些疾病的發(fā)生如“骨質(zhì)疏松癥”和機(jī)體內(nèi)脂肪細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞形成平衡失調(diào)有關(guān)。因此，對(duì)MSCs成脂分化和

2、成骨分化之間平衡的調(diào)控進(jìn)行機(jī)制探討對(duì)了解間充質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)制和骨相關(guān)疾病具有重要的意義。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約20-25bp的非蛋白編碼小RNA，主要通過抑制其靶基因的蛋白表達(dá)在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本文將以miR-22為主要研究對(duì)象，探討其對(duì)人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(humanadiposetissuederivedmesenchymalstemcells，hADMSCs)成脂成骨分

3、化的影響，并對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步地探討。
　　 本研究第一部分主要探討miR-22對(duì)hADMSCs成脂成骨分化的影響。首先，我們對(duì)hADMSCs成脂成骨分化過程中miR-22的表達(dá)量變化分別進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-22在成脂過程中表達(dá)量降低，而在成骨分化過程中表達(dá)升高，提示miR-22可能參與hADMSCs向成脂和成骨分化的調(diào)控。隨后，我們?cè)趆ADMSCs中過表達(dá)miR-22，并對(duì)過表達(dá)miR-22的hADMSCs分別進(jìn)行成脂

4、誘導(dǎo)培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)miR-22含量升高顯著地抑制了hADMSCs內(nèi)脂滴的形成，并使成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARΥ和C/EBPα以及成脂特異標(biāo)記物L(fēng)PL和FABP4的表達(dá)量顯著下調(diào)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)miR-22過表達(dá)提高了細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性、促進(jìn)了胞外基質(zhì)鈣化并且使成骨特異標(biāo)記物表達(dá)量顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明miR-22抑制hADMSCs成脂分化，促進(jìn)其成骨分化。
　　

5、 在本研究第二部分，我們對(duì)miR-22的下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)、篩選和鑒定。首先，通過miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan和miRanda對(duì)miR-22的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)初步挑選出7個(gè)與成脂分化或成骨分化調(diào)控直接或間接相關(guān)的靶基因作為候選靶基因；接下來我們通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)對(duì)候選靶基因進(jìn)行再次篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)出miR-22可以結(jié)合HDAC6的3'UTR的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后抑制作用。WesternBlot和RealTimePCR

6、結(jié)果表明miR-22可以在不影響HDAC6mRNA表達(dá)量的情況下，降低其蛋白含量。因此HDAC6被確定為miR-22的一個(gè)下游靶基因。我們將HDAC6作為下一部分的主要研究對(duì)象，探討miR-22調(diào)節(jié)hADMSCs成脂分化和成骨分化的分子機(jī)制。
　　 本研究第三部分主要對(duì)miR-22對(duì)hADMSCs成脂和成骨分化調(diào)節(jié)的下游機(jī)制，即miR-22靶基因“HDAC6”對(duì)hADMSCs成脂成骨分化的影響，進(jìn)行了探討。首先通過Western

7、Blot和RealTimePCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HDAC6在hADMSCs成脂分化過程中上調(diào)，而在成骨分化過程中下調(diào)。通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)手段降低hADMSCs內(nèi)HDAC6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HDAC6表達(dá)下調(diào)后，顯著抑制了hADMSCs向成脂分化，但促進(jìn)了其向成骨分化，與miR-22過表達(dá)后對(duì)hADMSCs分化的影響相一致。上述結(jié)果表明HDAC6可能是hADMSCs成脂分化的“促進(jìn)因子”及成骨分化的“抑制因子”