miR-125b調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨機(jī)制的研究-.pdf

1、研究背景和目的：隨著國內(nèi)人口年齡結(jié)構(gòu)逐漸步入老齡化，許多老齡化相關(guān)的疾病日漸引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。骨質(zhì)疏松作為一種老年人群高發(fā)的疾病，尤其重度骨質(zhì)疏松具有較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)此類骨折發(fā)生后容易遷延不愈，是嚴(yán)重影響老年人健康和生活質(zhì)量的一類骨科門急診常見病。世界衛(wèi)生組織已將骨質(zhì)疏松、糖尿病與心血管病一起列為影響中老年人健康的“三大殺手”。此外，臨床上因嚴(yán)重暴力所致的大段骨缺損、骨折后不愈合以及骨不連一直以來都是創(chuàng)傷骨科中的治療難點(diǎn)。以上疾

2、病的發(fā)生和發(fā)展均與機(jī)體內(nèi)骨代謝失衡，成骨能力受損密切相關(guān)。因此，對成骨機(jī)制的研究和探索，將可能為這些臨床問題的解決提供支持。
　　人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）作為成骨細(xì)胞重要的一種前體細(xì)胞，在骨的形成和成骨分化上都起著重要的作用。隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨機(jī)理的研究不斷深入，將有助于更好地理解多種骨病的病理過程，為此類疾病的治療尋找新的思路。此外，hBMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，是骨組織工程領(lǐng)域最重要的種子細(xì)胞來源

3、，同時(shí)在干細(xì)胞移植領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　micro RNA（miRNAs）是一類廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非編碼單鏈小分子RNA，它能夠與靶基因的3’非翻譯區(qū)部分堿基互補(bǔ)結(jié)合，繼而調(diào)控基因的表達(dá)，在生物體內(nèi)眾多基本的生理和病理過程中都扮演著重要的角色。近年來，越來越多的研究表明miRNAs在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要的調(diào)控作用，并且直接參與了諸多骨病如骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　有研究

4、發(fā)現(xiàn)，miR-125b在成骨過程中下調(diào)，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全明了。本研究選定miR-125b作為研究對象，希望通過對miR-125b調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究。進(jìn)一步豐富干細(xì)胞成骨定向分化的理論體系，同時(shí)可加深對骨骼發(fā)生、發(fā)育的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)，為骨質(zhì)疏松防治，骨折治療，骨缺損修復(fù)尋找新的治療思路并提供理論支持。
　　研究方法：
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。使用密度梯度離心的方法，從健康成年志

5、愿者捐獻(xiàn)的骨髓中分離獲取hBMSCs，通過傳代、培養(yǎng)、純化，獲取穩(wěn)定的干細(xì)胞來源。培養(yǎng)過程中注意觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)變化，使用 MTT法檢測其增殖活力。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原對細(xì)胞屬性進(jìn)行鑒定，通過成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化，對hBMSCs的多向分化能力即干性進(jìn)行鑒定。
　　2. miR-125b對hBMSCs成骨分化的影響。用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。首先將人工合成的 miR-125-pre和miR-125b-inhib

6、itor核酸序列構(gòu)建到慢病毒載體并轉(zhuǎn)染hBMSCs。對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和增殖能力進(jìn)行觀察檢測。然后，采用Real Time RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá)量的變化。最后，使用Real Time RT-PCR和Western Blot對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中重要的成骨因子包括ALP，Runx2， OSX以及OCN的表達(dá)情況進(jìn)行核酸和蛋白水平上的檢測，觀察其表達(dá)變化情況。采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色的方法對轉(zhuǎn)

7、染后的細(xì)胞進(jìn)行染色觀察，通過細(xì)胞顯色情況鑒定其成骨分化能力。
　　3. miR-125b調(diào)控hBMSCs的作用靶點(diǎn)預(yù)測及驗(yàn)證。首先，選用生物信息學(xué)的方法，使用TargetScan，miRanda及Pic Tar作為靶基因預(yù)測工具，對可能與 miR-125b結(jié)合的靶基因序列進(jìn)行篩選預(yù)測，選擇可能與其結(jié)合的潛在靶點(diǎn) BMPR1b作為研究對象。隨后，構(gòu)建 BMPR1b的熒光素酶報(bào)告載體，使用雙熒光素酶報(bào)告的方法對所預(yù)測的靶基因進(jìn)行初步驗(yàn)

8、證。最后，將hBMSCs分別轉(zhuǎn)染miR-125b的上調(diào)和下調(diào)慢病毒載體，使用Real Time RT-PCR和Western Blot檢測當(dāng)細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá)水平變化時(shí)，BMPR1b的mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　4. miR-125b抑制hBMSCs成骨分化的機(jī)制。首先使用Real Time RT-PCR和Western Blot檢測hBMSCs成骨過程中BMPR1b的表達(dá)變化。隨后，采用RNAi技術(shù)，將BMPR1b的s

9、iRNA載體轉(zhuǎn)染hBMSCs，使用Real Time RT-PCR和Western Blot檢測Runx2， OSX以及OCN的mRNA和蛋白表達(dá)變化。采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色的方法對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行染色觀察，鑒定成骨分化能力。最后，將miR-125b-inhibitor與si-BMPR1b共轉(zhuǎn)染hBMSCs，使用Real Time RT-PCR和Western Blot檢測Runx2， OSX以及OCN的mRNA和蛋白表達(dá)變化。

10、采用堿性磷酸酶染色和茜素紅染色的方法對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行染色觀察，鑒定成骨分化能力。
　　5. miR-125b調(diào)控hBMSCs成骨分化的體內(nèi)研究。首先，建立裸鼠股骨原位骨缺損模型。隨后，將miR-125b-inhibitor轉(zhuǎn)染hBMSCs，將細(xì)胞復(fù)合至 DBM后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，再通過手術(shù)的方式將 DBM移植至裸鼠體內(nèi)，利用micro CT觀測新骨生成狀況，采用組織切片，HE染色和Masson染色，從細(xì)胞的微觀角度評(píng)估成骨能力。

11、r>　　研究結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)所采用的密度梯度離心法分離獲取hBMSCs，培養(yǎng)過程中細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)表明hBMSCs細(xì)胞形態(tài)正常，具有較強(qiáng)的增殖活力。hBMSCs的陽性表面抗原CD73, CD90,和 CD105陽性率均在95％以上，而陰性抗原 CD34，CD45，CD14，CD19， HLA-DR陽性率在5％以下。符合hBMSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)。此外，分離培養(yǎng)的hBMSCs具備成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力，具備良好的干性。

12、　　2.在hBMSCs向成骨分化的過程中，miR-125b處于低水平表達(dá)的狀態(tài)。慢病毒載體對hBMSCs轉(zhuǎn)染效果較好，且對細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響。在hBMSCs成骨分化過程中，上調(diào)miR-125b表達(dá)能夠抑制成骨。相反地，下調(diào)miR-125b則能夠促進(jìn)hBMSCs的成骨分化。
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測出BMPR1b基因可能是miR-125的作用靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-125b在細(xì)胞內(nèi)能與BMPR1b的3’ UTR部分堿基序

13、列存在結(jié)合位點(diǎn)。在hBMSCs中，上調(diào)miR-125b能夠抑制BMPR1b的mRNA和蛋白表達(dá)。相反，下調(diào)miR-125b則能夠增加BMPR1b的mRNA和蛋白表達(dá)量。
　　4. hBMSCs成骨分化過程中，BMPR1b呈高表達(dá)狀態(tài)。沉默BMPR1b的基因后， hBMSCs的成骨能力下降。miR-125b-inhibitor與 si-BMPR1b共轉(zhuǎn)染 hBMSCs后， hBMSCs的成骨分化能力同樣受到抑制。
　　5.對

14、miR-125b調(diào)節(jié)成骨分化的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 miR-125b-inhibitor后的hBMSCs，micro CT和組織切片染色其體內(nèi)成骨能力強(qiáng)于陰性對照組。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的 hBMSCs增殖活躍，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。干細(xì)胞特性明顯，經(jīng)不同條件誘導(dǎo)，能向成骨、成脂以及成軟骨細(xì)胞分化。純度較高，干細(xì)胞來源穩(wěn)定可靠。
　　2. miR-125b能夠負(fù)向調(diào)控hBMSCs成骨分化。<