TNF-α通過miR-33a-5p對BMP-2誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程的調(diào)控.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子（TNF-α）是種植體周圍炎中主要的炎性因子，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）可以誘導(dǎo)新骨形成，但成骨效率受TNF-α介導(dǎo)的炎癥程度影響。微小RNAs（MiRNAs）是小片段非編碼的RNA分子，在TNF-α介導(dǎo)的炎性過程或BMP-2介導(dǎo)的成骨過程中均有參與,其中的機制未見報道。本實驗從TNF-ɑ為切入點，研究在BMP-2誘導(dǎo)成骨過程中，TNF-ɑ對人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs），miRNA和靶基因的調(diào)控作用。

2、>　　方法：⑴采用流式細胞儀及定向誘導(dǎo)分化方法鑒定分離培養(yǎng)的hBMSCs；堿性磷酸酶染色（ALP staining）及半定量實驗驗證TNF-α對hBMSCs成骨分化的負調(diào)控作用，同時通過AnnexinⅤ聯(lián)合PI染色法及cck8檢測TNF-α是否影響hBMSCs增殖和促進凋亡。⑵實時定量PCR（RT-PCR）對實驗組前期芯片結(jié)果篩選出的miRNAs進行hBMSCs驗證，觀察TNF-ɑ對BMP-2誘導(dǎo)成骨分化過程中miRNA表達的影響；并利

3、用miRNA靶點預(yù)測軟件對差異表達最明顯的miRNA（miR-33a-5p）進行靶基因預(yù)測。⑶雙熒光素酶報告基因技術(shù)驗證靶基因預(yù)測結(jié)果,RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)驗證miR-33a-5p對靶基因的調(diào)控方式；試劑公司化學(xué)合成miRNA inhibitor和mimic，轉(zhuǎn)染至hBMSCs，使miR-33a-5p表達沉默或增強，運用茜素紅染色，堿性磷酸酶染色及RT-PCR,Western Blot驗證相關(guān)成骨基因的

4、表達情況。⑷RT-PCR和Western Blot觀察BMP-2,TNF-α在不同濃度和時間點刺激后，SATB2表達情況。⑸試劑公司化學(xué)合成miR-33a-5p inhibitor,si-SATB2轉(zhuǎn)染至hBMSCs,茜素紅染色，堿性磷酸酶染色及RT-PCR,Western Blot驗證相關(guān)成骨基因的表達情況；最后，轉(zhuǎn)染SATB2過表達質(zhì)粒，驗證RUNX2信號通路是否受到影響。
　　結(jié)果：①hBMSCs分離培養(yǎng)后，經(jīng)鑒定高表達間充

5、值干細胞表面標志物，并具有多向分化能力；堿性磷酸酶染色和半定量實驗證實TNF-α對hBMSCs成骨分化的負調(diào)控作用；AnnexinⅤ聯(lián)合PI染色法及cck8排除TNF-α對hBMSCs增殖和凋亡的影響。②在hBMSCS中，TNF-ɑ對BMP-2誘導(dǎo)成骨分化的過程會導(dǎo)致miR-33a-5p表達明顯上調(diào)，并且這種作用主要來自于TNF-ɑ；經(jīng)軟件預(yù)測，SATB2有可能是miR-33a-5p的靶基因。③雙熒光素酶報告實驗顯示過表達 miR-33

6、a-5p后，能明顯抑制含野生型SATB2-3’UTR的熒光素酶的活性而對連接有突變的SATB2-3’UTR的熒光素酶活性沒有抑制作用，因此，SATB2是miR-33a-5p的直接靶基因；隨后，RT-PCR實驗排除miR-33a-5p對SATB2 mRNA降解可能性，Western Blot證實miR-33a-5p通過影響SATB2的蛋白轉(zhuǎn)錄抑制其表達；體外敲除miR-33a-5p后，hBMSCs成骨分化活性增高，而miR-33a-5p過

7、表達后，成骨分化活性降低。④BMP-2刺激1,3,7天后或濃度依次為50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml和200ng/ml時，SATB2表達逐漸增加；當加入不同濃度TNF-α后，SATB2 mRNA的表達隨 TNF-α濃度的增加而下降，而在TNF-α濃度為10ng,20ng和30ng時，SATB2蛋白表達卻無變化。⑤轉(zhuǎn)染miR-33a-5p inhibitor后，成骨相關(guān)基因表達明顯上升，而轉(zhuǎn)染si-SATB2，實現(xiàn)SAT