miR-125b通過靶向抑制Smad4表達調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化.pdf

1、目的：探討 miR-125b是否通過靶向調(diào)控 Smad4表達調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）成骨分化，揭示了miR-125b調(diào)控MSCs成骨分化過程的分子機制。
　　方法：利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓MSCs，并通過流式細(xì)胞技術(shù)鑒定MSCs表面分子標(biāo)志物，并誘導(dǎo)其向成骨分化，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性及成骨關(guān)鍵基因RUNX2、Osterix表達檢測MSCs成骨分化能力；將miR-125b mimics或 inhibitor

2、s轉(zhuǎn)染 MSCs細(xì)胞并進行成骨誘導(dǎo)，檢測過表達或干擾 miR-125b對MSCs成骨分化的影響；構(gòu)建Smad43'UTR-熒光素酶報告載體，與miR-125b共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，通過熒光素酶報告觀察miR-125b是否能與Smad43'UTR-特異性結(jié)合；將miR-125b mimics轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞并進行成骨誘導(dǎo)，采用qRT-PCR、Western blot檢測Smad4表達水平；在MSCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Smad4 siRNA并進行成骨

3、誘導(dǎo)，考察沉默Smad4表達是否影響MSCs成骨分化能力。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)的骨髓MSCs表達CD44、CD29，不表達CD34和CD45，符合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。骨髓 MSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)下后，ALP活性明顯升高，RUNX2和Osterix表達，說明MSCs具有成骨分化能力。過表達miR-125b抑制骨髓MSCs成骨分化，反之miR-125b則促進骨髓MSCs成骨分化。干擾雙熒光素報告檢測顯示，miR-125b能特異性

4、地與Smad4 mRNA的3’UTR結(jié)合。qRT-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，在MSCs成骨分化過程中上調(diào)miR-125b表達能顯著抑制Smad4表達。而沉默Smad4表達AKP活性及RUNX2、Osterix表達水平明顯下降，并且能部分模擬miR-125b調(diào)控 MSCs成骨分化的功能。
　　結(jié)論:
　　(1) miR-125b通過抑制靶基因Smad4的表達調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。
　　(2)利