MiR-29靶向抑制Robo1表達(dá)調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、第一部分沉默Robo1對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
　　目的:研究Robo1對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)小鼠BMSCs，構(gòu)建siRNA載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BMSCs，靶向沉默Robo1，QPCR和Western blot法驗證沉默效率，MTT和Brdu法檢測沉默Robo1基因后對BMSCs增殖的影響。
　　結(jié)果:Robo1-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后， Robo1基因表達(dá)量相

2、較于對照組Con-siRNA下調(diào)3倍左右，而且Robo1蛋白的表達(dá)水平相較于Con-siRNA組也明顯下調(diào);Con-siRNA和Robo1-siRNA分別轉(zhuǎn)染BMSCs，MTT及Brdu法檢測結(jié)果顯示使用siRNA沉默Robo1基因的BMSCs細(xì)胞生長受到顯著抑制，結(jié)論:Robo1與BMSCs生長密切相關(guān)，在Robo1被沉默后，BMSCs生長受到明顯抑制。
　　第二部分靶向調(diào)控Robo1的miRNAs的篩選及鑒定
　　目的:

3、篩選及鑒定靶向調(diào)控Robo1的miRNAs。
　　方法:用Targetscan、miRNAda等軟件進(jìn)行預(yù)測，以及文獻(xiàn)查詢，篩選出最有可能靶向抑制Robo1的miRNAs，并用miRNAs的mimic處理細(xì)胞，Westernblot檢測BMSCs中Robo1的表達(dá)差異，找到能明顯引起Robo1變化的miRNA。最后用雙熒光素酶報告基因法驗證miRNA對Robo1的靶向調(diào)控作用。
　　結(jié)果:利用生物信息學(xué)軟件對Robo1可能的

4、靶miRNAs進(jìn)行了分析，從眾多的靶miRNAs中篩選出最可能的靶miRNAs: miR-218、miR-29、miR-146、miR-148。分別用miR-218、miR-29a、miR-146和miR-148 mimics通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染BMSCs，Westem blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a時，Robo1下調(diào)最為明顯。在轉(zhuǎn)染克隆有野生型Robo13'-UTR質(zhì)粒的實驗組中，檢測熒光素酶活性顯示miR-29組與空白組比較

5、P＜0.01;miR-29組與陰性對照組比較P＜0.01，表明miR-29能與Robo1的3'-UTR結(jié)合，從而抑制螢光素酶的活性;而在轉(zhuǎn)染克隆有突變型mutRobo13'-UTR質(zhì)粒的實驗組中，miR-29組與空白組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明miR-29不能與mutRobo13'-UTR結(jié)合而抑制螢光素酶的活性。
　　結(jié)論:miR-29a通過與Robo1的3'-UTR結(jié)合而靶向抑制Robo1。
　　第三部分

6、miR-29a靶向調(diào)控Robo1抑制BMSCs增殖
　　目的:研究miR-29a靶向調(diào)控Robo1表達(dá)對BMSCs增殖的影響。
　　方法:采用慢病毒載體介導(dǎo)的miR-29a，根據(jù)miRNAbase上公布的pri-miR-29a的序列，合成并構(gòu)建在慢病毒骨架質(zhì)粒中，繼而和慢病毒的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞（293T，人胚腎細(xì)胞）進(jìn)行慢病毒包裝，繼而裂解細(xì)胞，純化帶有pri-miR-29a的慢病毒顆粒，用于感染細(xì)胞并進(jìn)行檢測增殖的細(xì)

7、胞實驗。
　　結(jié)果:本實驗成功構(gòu)建和包裝miR-29a慢病毒，然后選用BMSCs的代表株，通過MTT和Brdu法證明，過表達(dá)miR-29a可抑制BMSCs的增殖能力。real-time PCR和Western blot結(jié)果證明Robo1轉(zhuǎn)染BMSCs后，Robo1表達(dá)量顯著上調(diào)，過表達(dá)Robo1組可增強(qiáng)BMSCs增殖能力，而共轉(zhuǎn)染miR-29a和Robo1可回復(fù)miR-29a對BMSCs增殖能力的抑制作用。
　　結(jié)論:miR