miR-29a對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、微小RNAs(miRNAs)是一類大小約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA,在進(jìn)化中高度保守,其表達(dá)既具有時(shí)空特異性,也具有組織和細(xì)胞特異性。miRNAs通過與mRNA的3'端UTR序列互補(bǔ)而抑制其翻譯,從而廣泛地參與細(xì)胞生物學(xué)過程,包括發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝等。本實(shí)驗(yàn)室通過miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化后,miRNAs的

2、表達(dá)譜發(fā)生明顯改變,其中miR-29a的表達(dá)量較分化前增高最為明顯。已有研究表明,miR-29a在胚胎期組織中不表達(dá)或低表達(dá),但在生物體成熟組織細(xì)胞中廣泛表達(dá),也有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a在肉瘤、胃癌、白血病等癌癥中表達(dá)降低,提示miR-29a可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡。因此,我們推測(cè)miR-29a可能影響B(tài)MSCs的增殖分化過程并參與BMSCs的增殖分化調(diào)控。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的成體干細(xì)胞,廣泛存在于全身結(jié)締

3、組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富。BMSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。BMSCs在特定的誘導(dǎo)條件下能分化為特定的成體細(xì)胞,同時(shí)喪失增殖能力和多向分化潛能,被認(rèn)為是臨床細(xì)胞替代治療的理想細(xì)胞來源。但是,對(duì)BMSCs增殖特性的維持和分化調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)為了研究miR-29a對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,用慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體表達(dá)載體感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定miR-2

4、9a過表達(dá)和抑制時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與凋亡的變化,生物信息學(xué)分析miR-29a對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控靶位點(diǎn)和機(jī)制,進(jìn)一步探討miR-29a對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。
　　 目的：
　　 通過調(diào)節(jié)miR-29a在BMSCs中的表達(dá)狀態(tài),觀察miR-29a過表達(dá)和抑制時(shí)對(duì)BMSCs增殖和凋亡的影響,并分析其調(diào)控靶基因及作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.慢病毒的包裝和滴度測(cè)定。2

5、93T細(xì)胞復(fù)蘇和擴(kuò)增,分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-29a前體表達(dá)病毒載體(eGFP)、miR-29a前體表達(dá)病毒對(duì)照載體(空白對(duì)照,eGFP)、miR-29a抑制劑病毒載體(mCherry)、miR-29a抑制劑病毒對(duì)照載體與包裝載體(空白對(duì)照,mCherry),48 h收獲病毒上清,分別為L(zhǎng)vx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control,分別用病毒上

6、清液感染293T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)綠色或紅色熒光細(xì)胞陽性率并計(jì)算病毒滴度。
　　 2.慢病毒感染BMSCs。體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,傳代至第四代BMSCs用于病毒感染,分為L(zhǎng)vx-miR-29a組、Lvx-miR-29a對(duì)照組、Lvx-miR-29a(-)組和Lvx-miR-29a(-)-control對(duì)照組,分別加入Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-

7、miR-29a(-)-control(MOI=10)來感染BMSCs,感染6 d后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色或紅色熒光表達(dá),熒光定量PCR檢測(cè)各組miR-29a表達(dá)。
　　 3.增殖和凋亡檢測(cè)。慢病毒感染6 d后消化各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡。
　　 4.生物信息學(xué)分析。采用靶基因預(yù)測(cè)結(jié)合miRNA調(diào)控的基因表達(dá)譜分析:TargetScan6.0在線預(yù)測(cè)mo-miR-29a基因的可能靶基因,結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫中

8、miR-29調(diào)控的基因譜數(shù)據(jù),篩選出miR-29可能下調(diào)的基因集合,進(jìn)一步進(jìn)行GO分析,篩選出于增殖或凋亡相關(guān)的基因。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)值用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異,以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢病毒的包裝和滴度測(cè)定。293T細(xì)胞貼壁圓形、類圓形或多角形,排列整齊。包裝病毒后第五天即傳

9、代后24 h在熒光倒置顯微鏡下看到帶紅色或綠色熒光蛋白的細(xì)胞,流式細(xì)胞儀也檢測(cè)到帶紅色或綠色熒光蛋白的細(xì)胞,Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-control四組的熒光細(xì)胞陽性率分別為47.8％、63%、59%及63%,分別計(jì)算Lvx-miR-29a、Lvx-miR-29a-control、Lvx-miR-29a(-)、Lvx-miR-29a(-)-

10、control的病毒滴度,分別為7.17×107 IU/ml、9.45×107IU/ml、8.85×107 IU/ml、9.45×107IU/ml。
　　 2.慢病毒感染BMSCs。體外分離培養(yǎng)大鼠的BMSCs至第四代,可以得到純化的細(xì)胞,該細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈梭形,旋渦狀排列。病毒上清感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48 h后熒光倒置顯微鏡下可看到帶紅色或綠色熒光蛋白的梭形,貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。感染4～5天后,細(xì)胞的熒光達(dá)到最強(qiáng),5天后熒光無明顯

11、改變,轉(zhuǎn)染效率約為60%。病毒感染后第6天用熒光定量PCR檢測(cè)miR-29a的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,Lvx-miR-29a組中miR-29a增高(5.62±1.86)倍,Lvx-miR-29a(-)組降低為(0.269±0.075)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.增殖和凋亡的檢測(cè)。與對(duì)照組相比,Lvx-miR-29a組的S期細(xì)胞明顯減少,對(duì)照組和Lvx-miR-29a組處于S期的細(xì)胞分別占(17.41±

12、3.78)%和(8.52±3.06)%(P＜0.05),增殖指數(shù)分別為(30.99±4.82)%和(19.75±5.22)%(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:Lvx-miR-29a組和對(duì)照組(感染空載體)細(xì)胞的壞死率分別為(29.24±7.28)%和(14.34±4.33)%,凋亡率分別為(16.74±4.26%和(10.24±3.83)%;Lvx-miR-29a(-)和對(duì)照組(感染空載體)的細(xì)胞壞死率分別為(5.68±4.82

13、)%和(15.56±3.78)%,凋亡率分別為(4.14±2.45)%和(6.91±2.52)%。顯示miR-29a高表達(dá)促進(jìn)BMSCs凋亡(P＜0.05)。
　　 4.生物信息學(xué)分析。采用靶基因預(yù)測(cè)結(jié)合miRNA調(diào)控的基因表達(dá)譜分析,首先TargetScan6.0在線預(yù)測(cè)mo-miR-29a基因的可能靶基因(797個(gè),保守區(qū)結(jié)合),miR-29a上調(diào)引起468個(gè)基因下調(diào)(GEO database no.GSE30525),同時(shí)

14、滿足上述兩個(gè)條件的有58個(gè)基因(既是miR-29a靶基因同時(shí)受到miR-29a調(diào)控)。對(duì)這58個(gè)基因進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因與細(xì)胞周期相關(guān)(PTP4A1,HMGN3,MAFB,MYCN),6個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄因子功能(CSDA,EOMES,GAS7,MAFB,NFIA,MYCN),2個(gè)基因與凋亡相關(guān)(BAK1,MYCN)。在這些基因中,已有報(bào)道MYCN、HMGN3、NFIA和PTP4A1可促進(jìn)細(xì)胞增殖,MYCN基因抑制BMSCs凋亡,BA