miR-548d-5p靶向調(diào)控PPARγ基因表達(dá)對(duì)酒精誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　伴隨經(jīng)濟(jì)水平的逐步提高，飲酒的人越來越多，酒精性股骨頭壞死（alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head, AONFH）也成為骨科常見疾病之一，并有逐年增加的趨勢(shì)。在未經(jīng)有效治療者中約80％將發(fā)生股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)功能受損毀壞，有極高的致殘率，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活，此時(shí)保守治療也已失去臨床意義，因此預(yù)防酒精性股骨頭壞死的發(fā)生突顯重要。
　　目前，有多

2、種關(guān)于股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理，如微血管損傷學(xué)說、股骨頭內(nèi)脂肪栓塞學(xué)說、股骨頭內(nèi)高壓導(dǎo)致靜脈瘀滯學(xué)說、全身或局部高凝低纖溶學(xué)說以及骨質(zhì)疏松學(xué)說等等。經(jīng)過大量深入研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在酒精的影響下，不僅其股骨頭細(xì)胞內(nèi)成骨基因表達(dá)明顯降低，成脂基因表達(dá)明顯增高；而且其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMCSs）成脂分化和抑制其成骨分化，引起股骨頭內(nèi)脂肪沉積，內(nèi)壓升高，血供減少，最后造成股骨頭

3、缺血壞死。作為一種誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，過氧化物酶體增殖子活化受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）在脂肪分化中表達(dá),但在前脂肪細(xì)胞中不表達(dá),并比大多數(shù)脂肪基因先表達(dá),前脂肪細(xì)胞在沒有PPARγ時(shí)很難分化為脂肪細(xì)胞。
　　綜上可推測(cè)，如果PPARγ基因表達(dá)被阻斷，那么MBSCs在酒精誘導(dǎo)下成脂分化過程就可以被阻止；從而早期酒精性股骨頭壞死的有效預(yù)

4、防也成為可能。本研究擬將構(gòu)建的miR-548d-5p片段電轉(zhuǎn)入大鼠體外BMSCs中，靶向阻止BMSCs中的PPARγ基因表達(dá)，抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，從而在早期阻止酒精誘導(dǎo)BMSCs成脂分化的過程，即希望從酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)理的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上預(yù)防該疾病發(fā)生。
　　材料與方法：
　　選取2月齡雄性大鼠處死后取骨髓，制備大鼠BMSCs。實(shí)驗(yàn)分4組，空白對(duì)照組：未作特殊處理的BMSCs；模型組：0.09mol/L酒精+B

5、MSCs；無關(guān)序列組：0.09mol/L酒精+電轉(zhuǎn)入無關(guān)序列的BMSCs；基因組：0.09mol/L酒精+電轉(zhuǎn)入miR-548d-5p的BMSCs。
　　將制備的第2代BMSCs按分組條件處理后接種于6孔培養(yǎng)板中，并且按實(shí)驗(yàn)要求加入酒精，始終保持培養(yǎng)液中酒精濃度為0.09mol/L；而且，每次BMSCs換液時(shí)也要重新加入酒精，濃度仍為0.09mol/L。每天在倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，并做好實(shí)驗(yàn)記錄。

6、>　　在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第3和7天，采用TaqMan RT-PCR方法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ immunocytochemistry， ICC）分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中各組BMSCs內(nèi)PPARγmRNA、BMP-2 mRNA和Runx2 mRNA，以及相應(yīng)蛋白表達(dá)量的變化。在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第14天，用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)BMSCs中甘油三酯（Triglyceride， TG）含量和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,

7、 ALP)活性；在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第14天，將培養(yǎng)的BMSCs用油紅O進(jìn)行染色，并且計(jì)數(shù)脂肪細(xì)胞，最后做好實(shí)驗(yàn)記錄。
　　結(jié)果：
　　1、 BMSCs中PPARγ mRNA、BMP-2 mRNA及Runx2 mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果
　　酒精誘導(dǎo)第3和7天，模型組和無關(guān)序列組PPARγ mRNA呈高表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。基因組PPARγ mRNA呈低表達(dá)，與模型組和無關(guān)序

8、列組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。酒精誘導(dǎo)第3和7天，模型組和無關(guān)序列組BMP-2 mRNA及Runx2 mRNA均呈低表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而與空白對(duì)照組比較，基因組BMP-2 mRNA及Runx2 mRNA的表達(dá)水平接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：與模型組和無關(guān)序列組相比較，基因組和空白對(duì)照組中相關(guān)基因的蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義（P＜0.05）。
　　2、 BMSCs的成骨分化堿性磷酸酶活性及成脂分化甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果
　　酒精誘導(dǎo)第14天檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性及甘油三酯含量，與空白對(duì)照組比較，模型組和無關(guān)序列組中堿性磷酸酶活性均降低、甘油三酯含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與空白對(duì)照組比較，基因組中堿性磷酸酶活性稍降低、甘油三酯含量接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3、 BMSCs成脂分化油紅O染色和脂肪細(xì)胞

10、計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果
　　酒精誘導(dǎo)第14天油紅O染色后脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組和無關(guān)序列組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組和無關(guān)序列組兩組相比較，基因組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但是和空白對(duì)照組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.體外大鼠BMSCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明：miR-548d-5p可以有效阻斷酒精誘導(dǎo)BMS