TNF-α對負(fù)載種植體周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨創(chuàng)傷修復(fù)影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　種植學(xué)在國內(nèi)起步時間晚，但是發(fā)展速度快。人們對其優(yōu)缺點(diǎn)已耳熟能詳，且已成為臨床修復(fù)學(xué)的重要組成部分。在種植學(xué)發(fā)展中，學(xué)者們不斷地對影響其成功率的重要因素之一—生物力學(xué)進(jìn)行探索并取得了很大的進(jìn)展:如在種植時機(jī)、負(fù)載時間等相關(guān)問題的不斷提出探討并將其成果付諸實(shí)踐。
　　基于生物力學(xué)考慮，受到生理應(yīng)力刺激的骨組織與無生理應(yīng)力刺激相比，其成骨和抗應(yīng)力能力是增強(qiáng)的。對種植體行早期負(fù)載或即刻負(fù)載可能有利于骨結(jié)合的形

2、成。近年來相關(guān)研究逐步增多，在一定的生理?xiàng)l件下，避免過度的應(yīng)力集中是可以獲得較好骨結(jié)合的。相關(guān)的理論技術(shù)較為成熟，在臨床上受到患者認(rèn)可而已經(jīng)廣泛的應(yīng)用。有學(xué)者甚至認(rèn)為，主張對種植體延期負(fù)載僅僅是基于感性的經(jīng)驗(yàn)考慮。種植義齒在受到咬合力的刺激后，種植體骨界面發(fā)生相應(yīng)骨改建，這是與應(yīng)力作用下的骨代謝相密切相關(guān)聯(lián)的。
　　種植體傾斜一定角度后，其周圍應(yīng)力分布發(fā)生相應(yīng)變化，這種應(yīng)力變化必然對骨組織產(chǎn)生影響，其影響程度和研究目前知之甚少。在

3、種植義齒行使功能過程中，由于解剖因素、咬合方向變化會導(dǎo)致咬合力方向發(fā)生不同變化。由此而會導(dǎo)致應(yīng)力相同的情況下因角度變化產(chǎn)生種植體周圍的應(yīng)變則會不同。另一方面，對種植體骨界面所產(chǎn)生的骨結(jié)合不利之處在于種植體與骨組織應(yīng)力傳導(dǎo)過程中缺乏應(yīng)有的緩沖而可能發(fā)生種植體骨界面的微小裂痕。這種現(xiàn)象主要是由于在應(yīng)力傳遞在彈性模量差度較大兩種材料——種植體與骨組織間，因?yàn)閺椥阅Ａ肯嗖钤酱螅瑑烧邞?yīng)力引起的形變差距越大。應(yīng)力分布不同會相應(yīng)的引起其作用部位骨組織

4、的改建差異。應(yīng)力的差異越大，相應(yīng)的，改建的效果差異亦越大。而這種由不同角度引起的應(yīng)力對種植體周圍微環(huán)境是何種影響以及影響的程度如何的，骨組織在受這種角度引起的應(yīng)力后在其引起微環(huán)境相關(guān)因子-TNF-α變化的影響下是如何進(jìn)行改建的，相關(guān)研究較少。
　　TNF-α是多種生物學(xué)活性的炎癥因子，在牙周病發(fā)展過程中對組織造成破壞的主要因子。通過研究得知，它在牙周炎的發(fā)病機(jī)理中扮演著起重要的作用。因?yàn)門NF-α是促炎癥反應(yīng)的一種免疫調(diào)節(jié)劑，可以

5、促炎性細(xì)胞進(jìn)入感染部位，使金屬蛋白酶的釋放。后者降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)膠原纖維的破壞和牙槽骨吸收，同時調(diào)節(jié)牙周膜與牙齦成纖維細(xì)胞的增殖。TNF-α在健康和治療成功處于較低水平的位點(diǎn)，而在活動性破壞的位點(diǎn)卻是較高。在多數(shù)細(xì)胞中，TNF-α與TNFR1的結(jié)合激發(fā)TNFR結(jié)合的死亡受體結(jié)構(gòu)域蛋白(TRADD)、TNF受體結(jié)合因子2(TRAF2)、受體結(jié)合蛋白(RIP)復(fù)合物的形成。TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，提高破骨細(xì)胞活性，以此來促進(jìn)骨

6、吸收，同時亦有抑制成骨細(xì)胞骨形成。TNF-α可以抑制前成骨細(xì)胞分化成骨細(xì)胞，抑制骨鈣蛋白、成骨分化基因RUNX2和Ⅰ型膠原的表達(dá)。這說明TNF-α對骨吸收的影響至關(guān)重要，因此學(xué)者們不斷對其表達(dá)阻斷進(jìn)行研究以期獲得對其治療的方法。
　　近年來，針對TNF-α的研究逐漸增多，涉及范圍逐漸擴(kuò)展至種植學(xué)科領(lǐng)域。主要是通過種植體周圍炎的研究相對較多，研究方式通過測量種植體周圍齦溝液的含量變化進(jìn)行測定。但臨床上的很多的種植體周圍炎病因并不非常

7、明確，針對其預(yù)防更是無從談起。而目前針對由于生物力學(xué)因素引起的種植體周圍微環(huán)境的變化研究相對較少，特別是針對TNF-α影響更少。通過臨床可看出種植體植入時基本與原位自然牙的長軸存在一定的角度，這種角度所引起的種植體周圍應(yīng)力分布變化研究相對較少。在這種應(yīng)力作用下，TNF-α的變化如何以及其相應(yīng)變化與骨界面的改建影響如何，特別是對種植體周成骨細(xì)胞分化成骨的影響如何，未見相關(guān)研究。傾斜角度大小與種植體周圍TNF-α變化關(guān)系如何，以及兩者對成骨

8、細(xì)胞分化成骨影響狀況影響，目前尚未有研究見諸報(bào)道。
　　在臨床上負(fù)載種植體周圍骨組織改建無時不在進(jìn)行中。為了明確以下問題:負(fù)載種植體周圍微環(huán)境中的TNF-α的變化如何、對負(fù)載的種植體周圍骨組織改建影響如何、TNF-α濃度變化的影響和種植體骨改建變化以及對其中的種植體周骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響狀況，本課題研究中通過不同角度負(fù)載的種植體周圍應(yīng)力變化不同而測定其微環(huán)境中TNF-α的變化，將此為依據(jù)進(jìn)行種植體周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

9、和骨創(chuàng)傷修復(fù)影響研究。我們選擇臨床病例齦溝液量、TNF-α濃度測定;依據(jù)臨床角度測定結(jié)果，通過動物實(shí)驗(yàn)觀察齦溝液量、TNF-α濃度變化對骨結(jié)合情況和骨改建的影響;綜合臨床病例和動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究TNF-α對BMSCs增殖和成骨分化的影響，以探討炎性微環(huán)境對干細(xì)胞增殖與分化的影響，可以進(jìn)一步明確TNF-α對種植體骨界面骨組織變化的影響，有效地為臨床檢測TNF-α的水平變化提供預(yù)警，進(jìn)行早預(yù)防、早治療，為針對性的相關(guān)預(yù)防、治療措施提供依據(jù);

10、為應(yīng)用干細(xì)胞修復(fù)在炎性微環(huán)境中破壞的種植體周組織提供理論指導(dǎo)。
　　研究方法：
　　1.自臨床選擇種植義齒病例，測定相應(yīng)傾斜角度，按照術(shù)前設(shè)計(jì)模型測定與牙體長軸方向夾角歸為三組:0°-10°、10°-20°及20°以上。在負(fù)載后一個月及六個月后行采集齦溝液進(jìn)行定量分析和檢測TNF-α，測定TNF-α濃度隨種植體傾斜角變化;
　　2.通過在按照臨床選擇病例所測得傾斜角度，制作模板，常規(guī)方法將種植體植入成年犬頜骨內(nèi)并于負(fù)載

11、一個月及六個月后，用whatman42試紙行種植體周齦溝液的采集和定量檢測TNF-α，同時采取骨標(biāo)本進(jìn)行骨結(jié)合、骨密度、骨新生等檢測。對比分析不同角度傾斜種植體負(fù)載與測定的種植體齦溝TNF-α變化相關(guān)性;
　　3.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的取材、培養(yǎng)、分離純化，建立成骨細(xì)胞負(fù)載模型，免疫細(xì)胞化學(xué)染色和礦化誘導(dǎo)初步鑒定其干細(xì)胞特性;MTT法檢測不同濃度TNF-α對負(fù)載BMSCs增殖的影響;PNPP法檢測礦化誘導(dǎo)條件下不同濃度TNF-α對

12、負(fù)載BMSCs堿性磷酸酶活力的影響;實(shí)時定量PCR檢測不同濃度TNF-α對負(fù)載BMSCs成骨分化基因的影響;礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色法檢測不同濃度TNF-α對負(fù)載BMSCs礦化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.負(fù)載種植體角度測定和周圍齦溝液的TNF-α檢測與分析。
　　臨床檢測與動物實(shí)驗(yàn)均顯示種植體周齦溝液量和TNF-α的濃度變化在種植體傾斜20°以上時，與種植體傾斜20°以下存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　2.負(fù)載

13、的傾斜種植體周TNF-α檢測及其對骨修復(fù)的影響。
　　動物實(shí)驗(yàn)顯示，骨結(jié)合指數(shù)和新骨生長率在種植體傾斜20°以上時，與種植體傾斜20°以下存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　3.TNF-α對負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。
　　(1)TNF-α對不同負(fù)載BMSCs增殖的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　(2)TNF-α在1ng/ml時，與對照組（TNF-α為0ng/ml）相比，堿性磷酸酶活性和成骨分化

14、基因（RUNX2、OC、OSX和ALP）mRNA隨TNF-α濃度增加而增加;而在TNF-α高濃度(10，15，20ng/ml)時，堿性磷酸酶活性和成骨分化基因(RUNX2、OC、OSX和ALP)mRNA隨TNF-α濃度增高而下降;高低濃度的TNF-α對BMSCs堿性磷酸酶活性和成骨分化基因（RUNX2、OC、OSX和ALP）mRNA的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(3)BMSCs堿性磷酸酶活力、成骨分化基因（RUNX

15、2、OC、OSX和ALP）mRNA受應(yīng)變負(fù)載在生理范圍內(nèi)則是無明顯差異(p＞0.05);而超出生理應(yīng)變時，對堿性磷酸酶活性和成骨分化基因（RUNX2、OC、OSX和ALP）mRNA的影響差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(4)TNF-α在1ng/ml時，與對照組（TNF-α為0ng/ml）相比，BMSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)量無明顯差異(p＞0.05)，在TNF-α濃度高于10ng/ml時，BMSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)量顯著降低

16、(p＜0.05);與生理范圍內(nèi)應(yīng)變對礦化結(jié)節(jié)量的影響相比，超出生理范圍(5000με)時，應(yīng)變對礦化結(jié)節(jié)量的影響有明顯差異(p＜0.05)，在負(fù)載應(yīng)變生理范圍內(nèi)礦化結(jié)節(jié)量變化則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　(1)種植體傾斜角度在小于20°時，齦溝液量和周圍微環(huán)境TNF-α濃度變化較小;種植體傾斜角度大于20°時，種植體周圍齦溝液量明顯增多，而且TNF-α濃度較高，引起骨吸收，降低骨結(jié)合率和新骨形成;
　　(2)低濃度

17、TNF-α對種植體周微環(huán)境影響較小，而較高濃度的TNF-α抑制種植體骨界面的堿性磷酸酶活性、成骨分化基因（RUNX2、OSX、ALP和OC）mRNA以及并降低其礦化結(jié)節(jié)量;
　　(3)生理應(yīng)力范圍內(nèi)時，應(yīng)力變化對BMSCs增殖、堿性磷酸酶活性、成骨分化基因（RUNX2、OSX、ALP和OC）mRNA以及形成的礦化結(jié)節(jié)量的影響不明顯，較高濃度TNF-α則產(chǎn)生抑制作用;超出生理范圍的應(yīng)力變化則對BMSCs增殖、堿性磷酸酶活性、成骨分化