miR-155在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究miR-155在BMP9誘導(dǎo)成骨分化過程中的表達(dá)情況，探究miR-155對BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用，并對其相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法：
　　用BMP9腺病毒誘導(dǎo)C2C12和MEF細(xì)胞成骨分化，qRT-PCR檢測miR-155在成骨分化的0d，1d，3d，5d，7d的表達(dá)水平，并同時(shí)檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2和ALP的表達(dá)，對BMP9誘導(dǎo)的成骨分化進(jìn)行驗(yàn)證。miR-155模

2、擬物過表達(dá)或miR-155抑制劑抑制 miR-155的表達(dá)后通過ALP染色及活性檢測其對成骨分化早期的影響，茜素紅S（Alizarin Red S，ARS）染色觀察其對BMP9誘導(dǎo)的成骨分化晚期的影響。qRT-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2，OSX，ALP和OCN的表達(dá)，從基因水平檢測miR-155對BMP9誘導(dǎo)的成骨分化的作用。Western blot檢測 Runx2，p-Smad1/5/8的表達(dá)，以及晚期成骨標(biāo)志物OCN和OPN

3、的表達(dá)。生物信息學(xué)分析miR-155潛在靶基因，在眾多靶基因中選擇與BMP9誘導(dǎo)成骨分化作用密切相關(guān)的Runx2和BMPR2進(jìn)行分析，用qRT-PCR和Western blot檢測miR-155對其潛在靶基因的調(diào)控，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對miR-155與靶基因的直接靶向作用進(jìn)行驗(yàn)證。干擾其靶基因后qRT-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，探究靶基因在miR-155對 BMP9誘導(dǎo)的成骨分化作用中的影響。裸鼠皮下異位成骨以后取異位骨進(jìn)行mi

4、croCT掃描以及切片后進(jìn)行HE染色和Masson染色體內(nèi)驗(yàn)證miR-155對成骨分化的影響。
　　結(jié)果：
　　在BMP9誘導(dǎo)C2C12和MEF細(xì)胞成骨分化過程中，miR-155的表達(dá)呈現(xiàn)出一個(gè)先升高后降低的趨勢。過表達(dá) miR-155后，細(xì)胞的ALP染色減弱，活性減低，ARS染色減弱。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化過程中，過表達(dá)miR-155顯著降低Runx2，OSX，ALP和OCN的表達(dá)，而抑制miR

5、-155以后，其對成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用消失。Western blot結(jié)果顯示miR-155能顯著抑制Runx2和p-Smad1/5/8的表達(dá)，并能顯著降低晚期成骨標(biāo)志物OCN和OPN的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-155對其潛在靶基因Runx2和BMPR2的mRNA影響不大，但 Western blot結(jié)果顯示miR-155能顯著降低Runx2和 BMPR2的蛋白表達(dá)水平。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果指出miR-155能直接靶向

6、于Runx2和BMPR2，分別干擾Runx2和BMPR2后，qRT-PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物，結(jié)果顯示干擾了靶基因后，成骨相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)顯著降低，與過表達(dá) miR-155作用相似。裸鼠皮下異位成骨后取異位骨組織microCT掃描，結(jié)果表明 miR-155能抑制BMP9誘導(dǎo)MEF細(xì)胞皮下成骨的體積和密度，HE染色和Masson染色結(jié)果顯示miR-155能抑制異位骨的骨組織成熟度。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miR-1