TAp63α基因在BMP9誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、在進行骨折不連接、骨缺損和脊柱融合術治療時，采取骨移植的治療手段是臨床上所必需的。而在進行傳統(tǒng)治療后，新骨產(chǎn)生并替代的過程會耗上數(shù)月甚至數(shù)年，而且治愈后還會常發(fā)生再次骨連接不良、發(fā)生缺損等后遺癥，影響植骨效果。迄今為止，骨移植開始從植骨支架、能夠分化成為骨組織的干細胞和參與干細胞成骨分化的細胞因子三方面著手來避免骨移植治療的失敗。目前，植骨支架多使用Ⅰ型膠原，此膠原成海綿狀，對改善骨移植效果明顯;同時，已經(jīng)被人們所發(fā)現(xiàn)和使用的間充質(zhì)干細

2、胞使成骨種子細胞問題得以解決，但是由于間充質(zhì)干細胞能向多種細胞系分化，因此尋找特定的細胞因子能夠使間充質(zhì)干細胞定向分化成為成骨細胞成為目前該領域研究探索的熱點。
　　間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于結締組織和多種器官間質(zhì)中的多功能干細胞，其在特定的刺激下可以分化成為成骨細胞。而TGF-β超家族成員之一骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)可以誘

3、導間充質(zhì)干細胞分化成為成骨細胞，目前至少存在20多種BMPs，并且目前為止，研究發(fā)現(xiàn)BMP9的成骨誘導能力是最強的。已有研究表明，BMP9可以通過激活其下游的經(jīng)典信號通路BMPs-Smad信號通路和一些非經(jīng)典信號通路(例如MAPK、Wnt、PI3K/AKT)等來誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化，但目前對BMP9的上游調(diào)控因子了解甚少。
　　本課題希望通過探討腫瘤抑制因子p53家族中的p63轉錄因子對BMP9及其信號的調(diào)控進行進一步探索，試

4、圖進一步解釋BMP9具有很強誘導間充質(zhì)干細胞成骨的作用機制，為BMP9誘導成骨分化的分子機制提供更深的理論依據(jù)。
　　目的:
　　(1) p63基因是否與BMP9存在相互聯(lián)系，p63是否為BMP9的上游調(diào)控基因;(2) p63基因在BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化中的作用;(3) p63在BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化中發(fā)揮作用可能的作用機制。
　　方法:
　　第一部分:首先通過AdEasy系統(tǒng)構建p63的

5、全長亞型TAp63α和顯性負性突變亞型△Np63α的重組腺病毒，然后將AdTAp63α兩種腺病毒分別感染iMefs細胞以及p63-/-的iMefs細胞，通過PCR方法檢測在細胞過表達TAp63α的情況下BMP9 mRNA水平的變化。同時通ChIP的方法檢測p63是否是BMP9的上游調(diào)控因子，是否與BMP9的轉錄啟動子結合對BMP9的表達進行調(diào)控，并且在2周齡的C57小鼠的長骨生長板中檢測是否有p63蛋白的表達。
　　第二部分:在體

6、外實驗中，首先通過檢測早期成骨指標堿性磷酸酶(ALP)活性的變化來驗證TAp63α是否會促進BMP9誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。相反，△Np63α是否會抑制BMP9誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。然后通過茜素紅S染色以及免疫細胞化學的方法檢測骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)表達的變化來驗證TAp63α或者△Np63α是否會影響B(tài)MP9誘導的成骨晚期標志物的表達。隨后通過半定量PCR和定量PCR的方法來檢測TAp63α、△Np63

7、α對BMP9下游與成骨分化相關基因Osterix和Runx2表達的影響。在體內(nèi)實驗中，先將AdTAp63α、Ad△Np63α和AdBMP9分別或同時感染iMEFs細胞，然后將細胞收集起來對裸鼠進行皮下和肌肉內(nèi)注射，一個月后取出包塊進行microCT掃描，HE染色、Masson's Trichrome染色以及Alcianblue染色來檢測TAp63α、△Np63α是否對BMP9誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)異位成骨分化產(chǎn)生影響。
　　第

8、三部分:通過MTT實驗和流式細胞術分析TAp63是否會影響B(tài)MP9對間充質(zhì)干細胞增殖和細胞周期的調(diào)控而影響細胞的分化。另一方面，通過免疫細胞化學的方法檢測TAp63是否會通過BMP9下游的信號通路及其定位來影響B(tài)MP9對間充質(zhì)干細胞的分化的誘導效果。
　　結果:
　　通過第一部分實驗的研究發(fā)現(xiàn)，p63蛋白在2周大小的C57小鼠長骨生長板的軟骨細胞區(qū)域有所表達，并且在iMEFs(mouse embryonicfibroblas

9、ts，MEFs)細胞過表達TAp63α和向p63-/-的MEFs補回p63基因后，發(fā)現(xiàn)TAp63α能夠促進BMP9基因的表達，有趣的是，當細胞過表達BMP9后，TAp63α的表達反而下降，這間接說明p63可能為BMP9的上游調(diào)控基因，而BMP9的過表達會造成對p63的負反饋調(diào)節(jié)。同時，通過ChIP Assay，我們發(fā)現(xiàn)TAp63α可以與BMP9基因的轉錄啟動子結合，這進一步說明p63與BMP9不但存在相互作用，而且p63是BMP9的上游

10、調(diào)控基因。
　　通過第二部分實驗發(fā)現(xiàn)TAp63α能夠在體外促進BMP9誘導的早期成骨指標堿性磷酸酶(ALP)的活性，同時還能促進晚期成骨指標鈣鹽的沉積以及骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)表達，協(xié)同BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化。同時，TAp63α還能促進BMP9下游成骨相關轉錄基因Osterix和Runx2的表達。由于△Np63α是p63的顯型負性突變亞型，通過實驗證明其作用與TAp63α相反，對BMP99的誘導間充質(zhì)干細胞

11、成骨分化起拮抗作用。在體內(nèi)實驗中，TAp63α能夠促進BMP9誘導的皮下包塊以及肌肉包塊的骨組織面積的增大以及骨組織成熟度的增加，而與體外實驗一致，△Np63α的作用相反。這些結果說明，p63α可作為BMP9的上游調(diào)控基因能夠促進BMP9的成骨誘導作用。
　　在第三部分實驗中，通過MTT實驗，我們發(fā)現(xiàn)TAp63α抑制BMP9促進的細胞增殖，同時通過流式細胞術檢測BMP9誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞分化過程中各組細胞周期的變化，我們發(fā)現(xiàn)在

12、細胞同時感染了AdBMP9和AdTAp63α后24小時和48小時分別都檢測到TAp63α能夠促進G0/G1期細胞數(shù)量的增多，S期細胞數(shù)量減少，這提示TAp63α對BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化的促進作用可能與其能增加G0/G1期細胞的比例抑制細胞增殖促進細胞分化有關。通過免疫細胞化學染色的方法發(fā)現(xiàn)TAp63α可以促進BMP9的經(jīng)典信號通路中Smad1/5/8信號分子的磷酸化以及BMP9非經(jīng)典信號途徑p38MAPK和PI3K/Akt中