microRNA-494對腫瘤誘導(dǎo)的髓系抑制性細(xì)胞功能調(diào)控的機制研究.pdf

1、腫瘤的免疫逃逸機制是腫瘤研究的熱點問題,只有充分揭示腫瘤細(xì)胞在各個途徑各個水平上逃避免疫攻擊的機制,才有可能在設(shè)計和實施特異性的治療方案上取得突破.執(zhí)行負(fù)向免疫調(diào)控功能的抑制性細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮著舉足輕重的作用,比如腫瘤誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是腫瘤逃逸的重要環(huán)節(jié),近年被廣為研究。而越來越多的證據(jù)表明一群具有Gr-1和CD11b標(biāo)志的髓系來源抑制性細(xì)胞(Myeloid derived sup

2、pressorcells,MDSCs)與腫瘤進展關(guān)系十分密切,近年來在腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注.
　　 MDSCs是一個異質(zhì)性的細(xì)胞群體,它主要由不成熟的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和處于更早分化階段的髓系前體細(xì)胞組成.在正常生理情況下,在小鼠骨髓中大約有20％比例的CD11b+Gr-1+不成熟髓系細(xì)胞,在脾臟中也有少量分布,可迅速分化為成熟髓系細(xì)胞,也無免疫抑制功能。在荷瘤動物以及腫瘤患者體內(nèi)可見到這群細(xì)胞大量產(chǎn)生,并在各種組織

3、器官包括腫瘤局部聚集,并有很強的免疫抑制活性,促進腫瘤的免疫逃逸.小鼠來源的MDSCs共表達(dá)Gr-1和CD11b.已有的研究認(rèn)為腫瘤產(chǎn)生的一些因子以及免疫細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子對MDSCs的產(chǎn)生、活化和募集等過程發(fā)揮重要作用,主要包括VEGF、COX-2、GM-CSF、IL-4、IL-6等；而浸潤于腫瘤組織的MDSCs能通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和分化為內(nèi)皮細(xì)胞等方式促進腫瘤血管生成及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。MDSCs免疫抑制功能的研究主要集中在抗

4、原特異性CD8+T細(xì)胞,主要機制為:增加精氨酸酶(Arginase1,ARG1)的表達(dá)和活性從而耗竭L-精氨酸,下調(diào)TCR-CD3復(fù)合物ζ鏈的表達(dá)；或提高誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性,增加NO的合成和分泌,誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡；也可同時增加ARG1和iNOS的表達(dá)和活性,抑制T細(xì)胞；另有報道也可通過活性氧族(ROS)以及直接分泌抑制性因子如TGF-β。JAK／STAT是MDSCs擴增和活化的主要信號途徑,包括STAT1,STAT3和ST

5、AT6和MDSC的聚集和抑制功能相關(guān)。目前對Gr-1+CD11b+MDSCs的負(fù)相免疫功能有所了解,但尚有許多問題需要進一步深入研究。在分子水平,對MDSCs異常聚集的機制及其發(fā)揮免疫抑制的主要效應(yīng)分子如.ARG1、iNOS等表達(dá)的調(diào)控機制(如表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制)仍知之甚少。
　　 近年來,隨著對基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制認(rèn)識的增加,基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制被廣泛關(guān)注,而microRNA(miRNA)作為主要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子更是成為了

6、當(dāng)前的研究熱點。miRNA長度約為22個核苷酸,它通過結(jié)合在靶基因的mRNA的3’UTR抑制其翻譯,也有報道可具有一定的降解靶基因mRNA的能力。miRNA參與了機體的各種的生理病理過程,如生長、發(fā)育、分化、炎癥、腫瘤的發(fā)生.越來越多的研究顯示miRNA也顯著影響著免疫系統(tǒng)的各個方面,從造血、免疫細(xì)胞分化發(fā)育成熟以及免疫應(yīng)答功能的發(fā)揮,都與miRNA的調(diào)控相關(guān)。對于這個重要的抑制性細(xì)胞亞群Gr-1+CD11b+MDSCs而言,miRNA

7、調(diào)控很可能在其異常擴增和活化、發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用,但目前相關(guān)的研究報道甚少.
　　 基于這一點,我們首先用miRNA表達(dá)譜芯片篩選了可能與調(diào)控Gr-1+CD11b+MDSCs功能相關(guān)的miRNAs。分選4T1乳腺癌荷瘤小鼠和對照小鼠骨髓中的Gr-1+CD11b+MDSCs,通過應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片對比篩選得到8個miRNAs的表達(dá)水平存在顯著性差異,我們選擇了在腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs中表達(dá)顯著上調(diào)的miR-49

8、4作為本論文的研究對象。接著,我們進一步檢測了來自于兩個小鼠品系的共6個腫瘤模型小鼠體內(nèi)的Gr-1+CD11b+MDSCs中miR-494的表達(dá)水平,結(jié)果顯示相比于對照小鼠來源的Gr-1+CD11b+細(xì)胞,所有這6種腫瘤模型誘導(dǎo)的MDSCs都高表達(dá)miR-494,提示miR-494表達(dá)增加是腫瘤相關(guān)的MDSCs的共同特征。
　　 先前的報道提示,腫瘤細(xì)胞通過分泌多種可溶性介質(zhì)誘導(dǎo)MDSCs的聚集和活化,我們分離出正常小鼠骨髓來源

9、的Gr-1+CD11b+細(xì)胞,加入不同比例的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(TCCM),結(jié)果顯示TCCM可顯著誘導(dǎo)miR-494在MDSCs中的表達(dá)上調(diào),而且這種誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。同時,我們檢測到伴隨著miR-494的上調(diào),MDSCs分泌的抑制性效應(yīng)分子包括ARG1,iNOS2和促腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的效應(yīng)分子—金屬蛋白酶(MMP2,MMP13和MMP14)表達(dá)劇烈增加.提示miR-494的上調(diào)可能和MDSC的聚集或活化相關(guān)。為了確認(rèn)TCCM中何

10、種介質(zhì)參與誘導(dǎo)了miR-494的上調(diào),我們使用了多種細(xì)胞因子和生長因子替代TCCM,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以部分重現(xiàn)TCCM對MDSCs中miR-494表達(dá)的誘導(dǎo)作用,而在TCCM培養(yǎng)組內(nèi)加入TGF-β1阻斷抗體可以部分阻斷TCCM誘導(dǎo)的miR-494表達(dá)上調(diào)。我們進一步發(fā)現(xiàn),相比于同窩對照野生型小鼠,Smad3-／-小鼠來源的Gr-1+CD11b+細(xì)胞中的miR-494上調(diào)(TCCM介導(dǎo))被顯著地抑制。上述實驗結(jié)果提示,腫瘤細(xì)胞分泌的

11、可溶性因子尤其是TGF-β1可促進Gr-1+CD11b+MDSCs高表達(dá)miR-494,并且miR-494的增加可能與促進MDSCs效應(yīng)分子的表達(dá)相關(guān).
　　 為了探明miR-494在Gr-1+CD11b+MDSCs聚集和活化中發(fā)揮的可能作用,我們構(gòu)建了編碼pri-miR-494(Lv-494)和miR-494功能抑制序列(Lv-sponge)的慢病毒載體。用其進行體外轉(zhuǎn)染MDSCs,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-494顯著增加了MDS

12、Cs中效應(yīng)分子的表達(dá)(ARG1,iNOS2,MMP2,MMP13和MMP14),而抑制miR-494則明顯降低TCCM誘導(dǎo)的MDSCs效應(yīng)分子的上調(diào).為了確認(rèn)miR-494介導(dǎo)的MDSCs免疫抑制效應(yīng)的相關(guān)分子,以及MDSCs促腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)效應(yīng)分子的上調(diào)是否直接與MDSCs的功能相關(guān),我們檢測了不同病毒處理后的MDSCs對CD8+T細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞侵襲的影響.結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-494的Gr-1+CD11b+MDSCs顯著抑制CD

13、8+T細(xì)胞的增殖,還促進腫瘤細(xì)胞的侵襲,而這些效應(yīng)都能被相關(guān)分子的抑制劑阻斷.而且,過表達(dá)miR-494顯著增加了MDSCs的存活,而抑制miR-494可誘導(dǎo)MDSCs發(fā)生凋亡；提示miR-494的上調(diào)可能是MDSCs大量聚集的一個重要機制。同時,進一步實驗還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-494顯著增加了MDSC對SDF-1(CXCL12)誘導(dǎo)的趨化的反應(yīng)性.先前的報道已證實SDF-1介導(dǎo)的趨化是Gr-1+CD11b+MDSCs浸潤到腫瘤局部的重要

14、機制.上述結(jié)果顯示miR-494的高表達(dá)在Gr-1+CD11b+MDSCs的聚集和活化、免疫抑制功能的維持中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用,有可能是一個潛在的治療相關(guān)的靶點。
　　 接下來,為了驗證抑制MDSCs中的miR-494功能是否影響腫瘤的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移,我們建立了4T1高轉(zhuǎn)移乳腺癌小鼠模型,用Lv-sponge進行治療并觀察小鼠腫瘤生長、肺轉(zhuǎn)移以及生存期。結(jié)果顯示Lv-sponge治療顯著抑制原位腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移,而Lv-spo

15、nge治療的同時剔除CD8+T細(xì)胞雖然對原位腫瘤的生長無明顯抑制作用,但Lv-sponge介導(dǎo)的抑制肺轉(zhuǎn)移的作用仍很明顯。荷瘤24天后,聯(lián)合手術(shù)切除原位腫瘤顯著提高了小鼠的存活率。而對腫瘤組織的流式和切片的免疫熒光染色分析顯示,Lv-sponge顯著減少了腫瘤組織內(nèi)浸潤的Gr-1+CD11b+MDSCs的數(shù)量。上述結(jié)果表明miR-494可能成為腫瘤免疫治療的潛在靶點。
　　 microRNAs是通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)發(fā)揮其功能,我

16、們應(yīng)用了Targetscan和Pictar等對miR-494的靶基因進行分析.在數(shù)百個可能的靶基因中,PTEN引起了我們的注意,雖然尚沒有報道顯示PTEN在MDSCs中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,但是作為PI3K／Akt途徑的重要調(diào)節(jié)分子,以往的報道顯示PTEN負(fù)向調(diào)控SDF-1／CXCR4介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化和TGF—β1誘導(dǎo)的MMPs的表達(dá).為了驗證PTEN是否為miR-494調(diào)控MDSCs的功能靶點,我們首先比較了腫瘤小鼠和對照小鼠來源的Gr-

17、1+CD11b+MDSCs中PTEN的表達(dá)。結(jié)果顯示PTEN的mRNA水平?jīng)]有顯著性差異,但是腫瘤誘導(dǎo)的Gr-1+CD11b+MDSCs中PTEN的蛋白水平顯著降低,這符合microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。而報告基因?qū)嶒烇@示miR-494 mimic顯著抑制PTEN3'UTR熒光素酶報告基因的活性,轉(zhuǎn)染Lv-494可有效降低PTEN在MDSCs中的表達(dá),而Lv-sponge的作用正相反.以上結(jié)果表明miR-494靶向并抑制MDSCs

18、中PTEN的表達(dá).為了明確PTEN的降低是否介導(dǎo)miR-494對MDSCs功能的調(diào)節(jié)作用,我們構(gòu)建了編碼不合3’UTR區(qū)域的PTEN的慢病毒表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染MDSCs,我們發(fā)現(xiàn)在MDSCs中過表達(dá)PTEN不影響TCCM誘導(dǎo)的miR-494上調(diào),但阻斷了TCCM誘導(dǎo)的MDSCs中前述功能相關(guān)的所有效應(yīng)分子的上調(diào)。上述結(jié)果表明PTEN是miR-494發(fā)揮調(diào)控MDSCs的功能靶點。
　　 PTEN是P13K／Akt途徑的主要的負(fù)性調(diào)

19、節(jié)分子,我們進一步檢測了Akt、mTOR和NF-κB的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的MDSCs顯著高表達(dá)磷酸化的Akt、mTOR和NF—κBp65。TCCM也可誘導(dǎo)正常小鼠來源的Gr-1+CD11b+細(xì)胞中該途徑的顯著活化.而使用PI3K和mTOR及NF-κB的特異性抑制劑LY294002和雷帕霉素及BAY-117082則可阻斷TCCM誘導(dǎo)的Gr-1+CD11b+細(xì)胞的活化.
　　 綜上,本研究表明腫瘤通過分泌可溶性介質(zhì),尤其是TG

20、F-β1,誘導(dǎo)Gr-1+CD11b+MDSCs高水平地表達(dá)miR-494,miR-494通過靶向抑制PTEN,從而活化PI3K／Akt／mTOR信號途徑,促進MDSCs的存活,誘導(dǎo)MDSCs功能相關(guān)的效應(yīng)分子(ARG1,iNOS2,MMPs)的表達(dá),從而促進MDSCs的大量聚集和活化,并趨化到腫瘤局部,通過抑制腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答及降解細(xì)胞基質(zhì)等機制促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。
　　 上述結(jié)果揭示了microRNA介導(dǎo)的調(diào)控機