雙參顆粒調(diào)控髓源性抑制細(xì)胞構(gòu)筑肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　轉(zhuǎn)移前微環(huán)境是防治腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，被稱為可能引起腫瘤治療模式變革的重要研究方向。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的概念首先由Kaplan在Nature雜志中提出，2016年在Cancer Cell雜志上給予明確定義:一種具有支持性和接納性的組織微環(huán)境，通過一系列分子和細(xì)胞改變形成“指定”的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，或?yàn)槟[瘤細(xì)胞（“種子”）提供“肥沃”的“土壤”以利于其種植，從而為腫瘤定植于遠(yuǎn)端器官提供條件，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的干預(yù)成為不能及

2、時(shí)或完全切除原位腫瘤的患者預(yù)防或減少遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移的重要手段，通過干預(yù)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境以抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移逐漸成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，被譽(yù)為變革腫瘤腫瘤模式的新方向。
　　S1pr1-stat3激活的髓源性抑制細(xì)胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境構(gòu)筑及肺轉(zhuǎn)移過程中起到重要的支持作用。腫瘤細(xì)胞從原位溢出滲入血管、到達(dá)靶器官種植轉(zhuǎn)移是一十分復(fù)雜的過程，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的失敗都會阻止

3、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，研究顯示M DSCs在肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中聚集是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境構(gòu)建的關(guān)鍵，MDSCs與腫瘤細(xì)胞之間的交互作用是循環(huán)腫瘤細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵限速環(huán)節(jié)。而腫瘤細(xì)胞s1pr1-stat3信號通路激活引起的MDSCs細(xì)胞相應(yīng)信號通路活化及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中stat3的廣泛激活是MDSCs細(xì)胞得以在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中持續(xù)募集及生存的保證。通過干預(yù)MDSCs細(xì)胞S1pr1-stat3系統(tǒng)而抑制肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成是抑制肺轉(zhuǎn)移的可靠手段。選擇抗腫瘤轉(zhuǎn)移

4、有效的中藥方劑，發(fā)揮多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，干預(yù)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成可能為中藥治療腫瘤提供新的研究方向。
　　中醫(yī)治療腫瘤重在從整體上扶助人體正氣，預(yù)防腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。益氣活血法是在臨床實(shí)踐中摸索的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法，在該法指導(dǎo)下結(jié)合氣機(jī)升降理論由花寶金教授創(chuàng)立的雙參顆粒（西洋參、冬蟲夏草及三七）具有抑制肺轉(zhuǎn)移的臨床療效。且前期的初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙參顆?？娠@著減少肺中MDSCs的比例。雙參顆粒是否通過抑制MDSCs細(xì)胞中s1pr1-stat3

5、信號通路的激活起到抑制肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的作用是本研究的主要內(nèi)容。揭示雙參顆粒干預(yù)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制對進(jìn)一步配伍提高抗腫瘤轉(zhuǎn)移效率的研究有重要意義。且從理論上為中醫(yī)治未病，“先安未受邪之地”的理論提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)，對中醫(yī)治療腫瘤模式的變革具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　研究目的:
　　理論研究:以氣機(jī)升降理論為指導(dǎo)的益氣活血方劑在“先安未受邪之地”思想指導(dǎo)下抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究。
　　實(shí)驗(yàn)研究:分析氣機(jī)升降

6、理論與益氣活血法結(jié)合創(chuàng)立的雙參顆粒，探討其在干預(yù)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境防治腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，開展如下實(shí)驗(yàn):(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①觀察雙參顆粒通過干預(yù)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境對荷瘤小鼠原位腫瘤及肺轉(zhuǎn)移的影響，②研究雙參顆粒對肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs以及其s1pr1/stat3信號通路的影響③研究雙參顆粒對肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性腫瘤源性細(xì)胞因子(tumor-derivedsecreted factors，TDSFs)的作用;④雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境生物標(biāo)記物(Fib

7、ronectin，Lox，Versican，MMP9)表達(dá)的影響。(2)體外實(shí)驗(yàn):①探討雙參顆粒對腫瘤細(xì)胞分泌肺特異性TDSFs的作用，②在明確腫瘤細(xì)胞s1pr1-stat3信號通路激活對MDSCs分化影響之后，探討雙參顆粒對該過程的干預(yù)作用，③體外建立共培養(yǎng)模型，模擬轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，探討雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標(biāo)記物表達(dá)的作用?？傮w而言，探討氣機(jī)升降與益氣活血結(jié)合指導(dǎo)的雙參顆粒干預(yù)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境抗肺轉(zhuǎn)移的效果及其相關(guān)機(jī)制。

8、>　　研究方法:
　　(1)構(gòu)建Lewis肺癌C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，采用小動(dòng)物活體成像和定期取材（肺、瘤體）兩種方法，觀察雙參顆粒對原位腫瘤及肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　(2)利用熒光顯微鏡、免疫組化、酶標(biāo)儀熒光定量3種方法評估轉(zhuǎn)移前微環(huán)境動(dòng)物模型的構(gòu)建。
　　(3)利用ELISA方法，檢測肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境與轉(zhuǎn)移微環(huán)境中肺特異性TDSFs(VEGF、TGF-β、GM-CSF及TNF-α)的表達(dá)水平。
　　(4)利用

9、流式細(xì)胞檢測儀定量分析肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs的比例及表型變化。
　　(5)Western blot、免疫組化染色方法評估肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標(biāo)記物的水平。
　　(6)利用共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)移前微環(huán)境體外模型，觀察雙參顆粒醇提劑對模型中TDSFs、轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標(biāo)記物的影響。
　　(7)在共培養(yǎng)模型中，明確s1pr1-stat3信號通路激活的Lewis細(xì)胞對髓系細(xì)胞向MDSCs分化的作用，及雙

10、參顆粒的干預(yù)效果。
　　研究結(jié)果:
　　(1)雙參顆粒抑瘤效果:小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示:雙參顆粒組及5-FU組均可明顯抑制小鼠瘤體p/sec/cm2/sr(P＜0.05);14d天雙參顆粒有較明顯的抑制原位腫瘤生長的作用p/sec/cm2/sr(P＜0.05)，28d與對照組比較，原位腫瘤質(zhì)量相似(P＞0.05);5-Fu組在28d時(shí)仍有較顯著的抑制瘤體作用(P＜0.05)。
　　(2)抑瘤率:在接種Lewis細(xì)胞后第

11、14d、28d分別處死小鼠，剝離瘤體稱重計(jì)算抑瘤率:在14d、28d時(shí)雙參組和5-Fu的抑瘤率分別為38.2％、4.2％;41.8％、20.1％。
　　(3)肺轉(zhuǎn)移:接種Lewis細(xì)胞后第14d、17d、20d、23d、26d、29d、32d、35d分別處死小鼠，采用布氏液處理后肉眼觀察轉(zhuǎn)移灶、冰凍切片熒光顯微鏡觀察、組織研碎酶標(biāo)儀熒光定量分析、石蠟包埋切片HE染色觀察4種方法評估肺轉(zhuǎn)移情況，26d前雙參顆粒組和5-Fu組均較對照

12、組轉(zhuǎn)移減少(P＜0.05)，29d后雙參顆粒組和對照組肺轉(zhuǎn)移相似（P＞0.05）。
　　(4)肺中M DS Cs比例:和對照組相比，雙參顆粒組小鼠肺中MDSCs比例顯著降低(33.9％ vs.9.9％,P＜0.05)。
　　(5)血中腫瘤源性分泌性細(xì)胞因子:采用ELISA法，定量分析接瘤后14d、28d小鼠血中VEGF、TGF-β、GM-CSF及TNF-α的表達(dá)水平，結(jié)果和對照組相比，14d時(shí)SSG只對GM-CSF和TNF-

13、α有促進(jìn)恢復(fù)正常的作用(P＜0.05)，對VEGF、TGF-β無顯著作用;28d時(shí)SSG可顯著降低血中TGF-β、GM-CSF的表達(dá)水平(P＜0.05)，對VEGF及TNF-α無顯著影響。
　　(6)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中特異性生物標(biāo)記物:Versican、Fibronectin、Lox、MMP9被認(rèn)為是和肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境相關(guān)的生物標(biāo)記物。我們采用免疫組化染色方法、Western blot定性和定量評估各指標(biāo)的表達(dá)情況，兩種方法的結(jié)果基本

14、一致，雙參顆粒治療組較對照組均有顯著的下降(P＜0.05)。5-Fu與雙參組無顯著優(yōu)勢(P＞0.05)。
　　(7)雙參顆粒對體外轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中TDSFs的影響:在共培養(yǎng)模型中分別觀察12h、24h共培養(yǎng)上清液中TDSFs的變化，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)12h時(shí)各組TDSFs較對照組無顯著變化(P＞0.05)。24小時(shí)后TGF-β及GM-CSF在雙參顆粒組有顯著降低(P＜0.05)，VEGF和TNF-α無顯著變化。5-Fu對各種TDSFs均

15、無顯著抑制作用。
　　(8)雙參顆粒對s1pr1-stat3信號通路的作用。我們用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測s1pr1、stat3基因在各相關(guān)組織（肺、骨髓、腫瘤）細(xì)胞的表達(dá)情況，同時(shí)用western blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。我們發(fā)現(xiàn)雙參顆粒對腫瘤組織、骨髓組織及肺臟組織中兩種基因及蛋白的表達(dá)均有抑制作用(P＜0.05)。5-Fu只對腫瘤組織中兩種基因及蛋白的表達(dá)有抑制作用(P＜0.05)，對骨髓及肺中兩種基因及蛋白的表達(dá)作用不明顯

16、（P＞0.05）。
　　(9)雙參顆粒對髓系細(xì)胞向MDSCs分化的作用:首先，我們通過sew2871(s1pr1激活劑)激活Lewis細(xì)胞s1pr1-stat3信號通路。激活的Lewis細(xì)胞和髓系細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示MDSCs占髓系細(xì)胞的比例較對照組明顯增加(43％ vs.5％，P＜0.05)。其次，我們觀察了雙參顆粒對MDSCs分化的影響，發(fā)現(xiàn)野生Lewis細(xì)胞對MDSCs分化作用不明顯，雙參顆粒作用也不顯著;而雙參顆

17、粒醇提劑可通過抑制Lewis細(xì)胞s1pr1的表達(dá)，從而抑制髓系細(xì)胞向MDSCs細(xì)胞的分化(43％vs.0.7％)。5-Fu有相同的效果，兩組和對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(9)雙參顆粒對體外轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標(biāo)記物的作用:通過對模型中肺細(xì)胞和MDSCs細(xì)胞混合物做western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)，和單純的肺細(xì)胞或MDSCs對照組相比，雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中Version、Fi

18、bronectin、Lox、MMP9均有抑制作用(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　(1)氣機(jī)升降理論指導(dǎo)的益氣活血方劑雙參顆粒不僅對原位腫瘤有一定的抑制作用，還可通過調(diào)控轉(zhuǎn)移前微環(huán)境防治腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端靶器官種植轉(zhuǎn)移。
　　(2)雙參顆?？捎行p少肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs的含量及降低腫瘤細(xì)胞分泌的部分TDSFs。
　　(3) Lewis肺癌細(xì)胞s1pr1-stat3信號通路的激活與骨髓細(xì)胞向MDSCs的轉(zhuǎn)化