GITRL調(diào)控髓源性抑制細(xì)胞的分子機(jī)制及其在小鼠實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征中的作用.pdf

1、原發(fā)性干燥綜合征（primary Sj?gren’s syndrome, pSS）是一種以進(jìn)行性炎癥和唾液腺、淚腺等外分泌腺損傷為特征的自身免疫性疾病。其發(fā)病原因及機(jī)制尚不十分明確。目前認(rèn)為，原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病主要和易感基因、性激素和環(huán)境因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn) pSS與Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡被打破以及Th17細(xì)胞的參與相關(guān)，病變組織中存在 T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞的浸潤。原發(fā)性干燥綜合征除了會(huì)累及其他器官的病變之外

2、，還會(huì)增加 B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率。
　　髓源性抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells, MDSCs）是一群具有免疫抑制能力、未成熟的異質(zhì)性髓系細(xì)胞，包括粒細(xì)胞樣MDSCs（ granulocytic, G-MDSCs）和單核細(xì)胞樣 MDSCs（monocytic MDSC, M-MDSCs）。在健康個(gè)體的骨髓中，MDSCs能夠迅速分化為成熟的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞。而在病理狀況下，

3、MDSCs的分化過程受阻，并大量積聚于體內(nèi)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而該細(xì)胞在疾病中的具體作用仍存在爭議。研究顯示，MDSCs在不同的自身免疫性疾病中可能存在不同的作用。即使在同一種自身免疫性疾病中，MDSCs的變化及功能也不盡相同。這可能與疾病的發(fā)病機(jī)理、疾病的內(nèi)環(huán)境、疾病發(fā)病不同階段的差異以及所研究MDSC亞群不同有關(guān)。那么，MDSCs及其亞群在原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著什

4、么樣的作用呢？為此，我們首先建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征模型（experimental Sj?gren’s syndrome, ESS），且通過 ESS分析疾病發(fā)生發(fā)展過程中MDSCs比例和功能的動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)而，在此基礎(chǔ)上研究調(diào)控MDSCs功能的分子機(jī)制。
　　一、小鼠實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征發(fā)展進(jìn)程中MDSCs比例和功能的變化
　　首先，我們構(gòu)建了小鼠 ESS模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)，ESS小鼠的唾液流速明顯低于對(duì)照組小鼠，抗唾液腺蛋白抗

5、體、抗 M3R抗體和ANA等自身抗體水平顯著高于對(duì)照組小鼠。另外，ESS小鼠的唾液腺體和頸部淋巴結(jié)顯著增大，且唾液腺組織病理學(xué)檢查顯示20周的ESS小鼠唾液腺中浸潤了大量的淋巴細(xì)胞，且有腺管的破壞。由此，確定了ESS模型的成功建立。
　　接著，我們研究 ESS發(fā)展進(jìn)程中MDSCs及其亞群比例和數(shù)目的變化。通過流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)觀察了不同時(shí)期的ESS小鼠體內(nèi)MDSCs的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠開始出現(xiàn)臨床癥狀，即唾液分泌開始減少時(shí)，小鼠的

6、脾臟、淋巴結(jié)、外周血中的MDSCs的比例明顯升高，且在初次免疫后18天時(shí)達(dá)到高峰，疾病晚期（10周）達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的高水平狀態(tài)，并且局部唾液腺組織中也開始出現(xiàn) MDSCs的浸潤。同時(shí)，脾臟中M-MDSCs和G-MDSCs這兩個(gè)亞群的數(shù)目也隨著疾病的進(jìn)程明顯升高。
　　我們進(jìn)一步分析 ESS發(fā)展進(jìn)程中MDSCs及其亞群的功能。通過磁珠以及流式細(xì)胞術(shù)分選ESS早期（18天）和晚期（10周）的小鼠脾臟中的MDSCs及其亞群，檢測MDSCs

7、功能相關(guān)的主要效應(yīng)分子（Arg-1、NO）和表面分子（CD40、CD80、CD86、MHCII），以及其對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制能力。結(jié)果顯示，早期ESS小鼠脾臟中的MDSCs及其亞群具有較強(qiáng)的抑制能力，而隨著疾病的發(fā)展，晚期脾臟中MDSCs及其亞群的抑制能力明顯減弱。并且發(fā)現(xiàn)晚期的MDSCs及其亞群的抑制性效應(yīng)分子表達(dá)下降，同時(shí) CD40、CD80、CD86、MHCII等表面分子表達(dá)明顯上調(diào)，顯示其成熟度的上升。由此可見， ESS小

8、鼠體內(nèi) MDSCs及其亞群免疫抑制能力隨著疾病的進(jìn)展逐漸下降。
　　通過過繼轉(zhuǎn)移不同時(shí)期的MDSCs于 ESS小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)早期的MDSCs能夠顯著抑制 ESS小鼠唾液流速下降，降低自身抗體的水平，以及 Th1和 Th17細(xì)胞的比例，從而有效延緩 ESS的發(fā)生發(fā)展；而晚期的MDSCs不僅沒有明顯的治療效果，反而能夠上調(diào)抗唾液腺蛋白抗體的升高，以及唾液流速的下降程度，增加局部淋巴結(jié)中Th1和 Th17細(xì)胞的比例上升，顯示其對(duì) ESS

9、具有一定的促進(jìn)作用。
　　那么，我們接下來的問題就是為什么 ESS小鼠體內(nèi) MDSCs的免疫抑制功能會(huì)隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化呢？因此，我們進(jìn)行了第二部分的實(shí)驗(yàn)研究。
　　二、GITRL對(duì)MDSCs功能的調(diào)控
　　糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)配體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein ligand，GITRL）

10、是TNF超家族成員之一，研究報(bào)道指出GITRL主要參與對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞功能的調(diào)控。近年來，越來越多的證據(jù)表明GITRL能夠參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。通過動(dòng)態(tài)觀察ESS小鼠體內(nèi) GITRL的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的進(jìn)程，ESS小鼠脾臟、淋巴結(jié)和唾液腺中GITRL的表達(dá)顯著升高。此外，我們還首次發(fā)現(xiàn) ESS小鼠來源的MDSCs表達(dá) GITR， GITRL體外刺激能夠下調(diào)早期 MDSCs的免疫抑制能力。將 GITRL處

11、理后的MDSCs過繼轉(zhuǎn)移到 ESS小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠唾液流速并沒有恢復(fù)正常，相關(guān)的多種自身抗體水平依舊保持在較高水平，效應(yīng)性Th1和Th17細(xì)胞的比例沒有出現(xiàn)下降。這說明 GITRL蛋白處理后的MDSCs喪失了原有的抑制功能。
　　為了進(jìn)一步觀察GITRL對(duì)ESS小鼠體內(nèi)MDSCs的調(diào)控，我們給 ESS小鼠注射外源性 GITRL蛋白，發(fā)現(xiàn)外源性的GITRL能夠顯著下調(diào) ESS小鼠體內(nèi) MDSCs的免疫抑制功能。進(jìn)一步地，我們利用小干

12、擾 RNA下調(diào) MDSCs表面 GITR的表達(dá)后，將其過繼轉(zhuǎn)移至ESS小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高濃度的GITRL內(nèi)環(huán)境下，干擾 GITR后的MDSCs能夠有效地抑制 ESS小鼠唾液流速的下降；自身抗體水平也顯著降低，且Th1和Th17細(xì)胞的比例明顯下降。這些結(jié)果都進(jìn)一步證明了GITRL通過與MDSCs表面GITR結(jié)合，下調(diào)MDSCs的免疫抑制能力，從而促進(jìn)小鼠ESS的發(fā)生發(fā)展。
　　綜上所述：ESS發(fā)病過程中體內(nèi)逐漸升高的GITRL可