枯否細(xì)胞在昆明小鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌發(fā)生中的作用研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)及世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已占所有惡性腫瘤的5％以上。隨現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，近年盡管已涌現(xiàn)出生物免疫治療、射頻消融、超聲聚焦、肝臟移植等一系列新的治療手段，并取得了一定的療效，但因HCC惡性程度高，流行病學(xué)調(diào)查顯示出現(xiàn)癥狀者5年生存率仍不到5％。因此，進(jìn)一步深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，以研發(fā)出新的治療措施及靶點(diǎn)成為目前

2、腫瘤研究的熱點(diǎn)。單核．巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(Mononuclear phagacytic system，MPS)是機(jī)體免疫防御的重要組成部分，活化的MPS通過(guò)吞噬作用、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Amibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)、分泌細(xì)胞因子等途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生溶解和殺滅作用。Carl von于1886年首先描述肝臟中星形固定的巨噬細(xì)胞，并命名為枯否細(xì)胞(Kupfferce

3、lls，KCs)。KCs是機(jī)體最大的巨噬細(xì)胞群體，在抑制腫瘤形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮著重要的腫瘤防御作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)特異性的MPS功能抑制劑氯化釓(Gadoliniuin chloride，GdCl<,3>)抑制KCs功能后，觀察其對(duì)昆明小鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步證實(shí)KCs在HCC發(fā)生發(fā)展中的防御作用，并探討相關(guān)機(jī)制，為研發(fā)出新的治療措施及靶點(diǎn)提供依據(jù)。 方法: 60只25±5g的4W雄性健康昆明小鼠，經(jīng)右肝前

4、葉包膜下接種0.2ml(2×10<'5>)H22細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)性肝癌模型，并隨機(jī)分成兩組(各30只)：Gdcl<,3>預(yù)處理組(Gadolinium chloride treatment group，GCG)于接種H22細(xì)胞前1W開始，1次/3d自尾靜脈注入濃度為0.25％的Gdcl<,3>溶液10mg/Kg；肝癌組(Hepatocellular carcinoma group，HCCG)于接種H22細(xì)胞前1W開始，1次/3d自尾靜脈

5、注入0.2ml生理鹽水。同時(shí)以20只未作任何處理的同齡健康昆明小鼠為正常對(duì)照組(Normal control group，NCG)。以Gdcl<,3>預(yù)處理組、肝癌組及正常對(duì)照組各10只，在實(shí)驗(yàn)觀察期60d內(nèi)，繪制生存曲線； Gdcl<,3>預(yù)處理組(20只)和肝癌組(20只)，于接種H22細(xì)胞3W后處死，并以未作任何處理的小鼠10只作為正常對(duì)照組，分別測(cè)定：腫瘤組織質(zhì)量；光鏡下觀察腫瘤組織生長(zhǎng)情況，電鏡下觀察KCs超微結(jié)構(gòu)；免疫組織化

6、學(xué)染色鑒定肝臟及腫瘤組織KCs并觀察其分布范圍和及計(jì)數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血清TNF-α水平；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)測(cè)定肝臟TNF-αmRNA表達(dá)水平。 結(jié)果: (1)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)

7、果顯示：觀察期內(nèi)(60d)正常對(duì)照組小鼠無(wú)死亡；肝癌組與Gdcl<,3>預(yù)處理組生存時(shí)間分別為：40.5±3.5d和30.5±2.5d，3組生存時(shí)間逐漸縮短，Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)表明差異具有顯著性(P<0.05)。(2)H22腫瘤細(xì)胞接種3W后，肉眼觀察Gdcl<,3>預(yù)處理組癌灶的體積明顯大于肝癌組，兩者質(zhì)量分別為1.56±0.14g及3.18±0.25g，差異具有顯著性(P<0.05)。(3)HE染色顯示光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組肝小

8、葉形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)和中央靜脈結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列規(guī)律。肝癌組和Gdcl<,3>預(yù)處理組均可見(jiàn)癌組織細(xì)胞排列紊亂，異型性明顯，癌旁肝組織有較多KCs浸潤(rùn)，但是Gdcl<,3>預(yù)處理組腫瘤浸潤(rùn)面積更大且可見(jiàn)衛(wèi)星結(jié)節(jié)。(4)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組肝臟KCs形態(tài)良好，胞漿內(nèi)吞噬溶酶體少，吞噬活性無(wú)明顯增強(qiáng)。肝癌組癌旁組織肝血竇中KCs胞質(zhì)吞噬體和溶酶體增多，核明顯腫大增大不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)，并可見(jiàn)胞膜與癌細(xì)胞膜相連；Gdcl<,3

9、>預(yù)處理組KCs則沒(méi)有明顯激活的表現(xiàn)。(5)免疫組織化學(xué)染色顯示KCs呈卵圓形、星形或紡錘形；細(xì)胞計(jì)數(shù)表明肝癌組癌旁肝組織和遠(yuǎn)癌肝組織中KCs數(shù)量分別為9.40±2.37個(gè)/HP、9.50±2.17個(gè)/HP；Gdcl<,3>預(yù)處理組的癌旁肝組織和遠(yuǎn)癌肝組織中KCs數(shù)量為9.20±1.87個(gè)/HP、9.08±2.10個(gè)/HP；正常對(duì)照組的肝組織中KCs數(shù)量為4.80±1.31個(gè)/HP；雖然在Gdcl<,3>預(yù)處理組、肝癌組的癌旁肝組織及遠(yuǎn)

10、癌肝組織的KCs數(shù)量較正常肝組織明顯增加(P<0.01)，但兩者之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。(6)ELISA測(cè)定正常對(duì)照組、Gdcl3預(yù)處理組及肝癌組各組小鼠血清TNF-α水平分別為：1.635±0.237ng/L、3.964±0.205ng/L和4.977±0.357ng/L，Gdcl3預(yù)處理組和肝癌組TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)肝癌組又明顯高于Gdcl<,3>預(yù)處理組(P<0.01)； RT-PCR半

11、定量結(jié)果分析顯示，肝組織TNF-αmRNA表達(dá)水平在正常對(duì)照組、Gdcl<,3>預(yù)處理組與肝癌組逐漸升高，其相對(duì)含量分別為1.6、3.5和8.0，差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論:(1)Gdcl<,3>預(yù)處理雖然對(duì)KCs的數(shù)量沒(méi)有影響，但明顯抑制KCs功能；(2)KCs功能抑制致TNF-α產(chǎn)生減少，機(jī)體腫瘤免疫機(jī)能明顯下降，從而腫瘤生長(zhǎng)加速并易于轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠生存時(shí)間縮短；(3)加強(qiáng)對(duì)KCs的保護(hù)肝細(xì)胞、抑制其惡性轉(zhuǎn)化的