TiM-1信號通路在小鼠實驗性結(jié)腸炎中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制和病因非常復雜，我們的前期研究和文獻報道發(fā)現(xiàn)TLR信號通路和Th免疫反應(yīng)的異常在其中起著十分重要的作用，并且這些異常在不同類型的IBD(CD和UC)中有所不同，但是其發(fā)生機制尚不明確。為何不同類型的IBD會出現(xiàn)不同的Th優(yōu)勢反應(yīng)，它們的調(diào)控機制不清楚。Tim-1信號通路是最新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)Th免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，并且與TLR信號通路有著密切的關(guān)系。然而Tim-1信號通路在IBD發(fā)生發(fā)

2、展中的作用，及它與IBD的Th免疫反應(yīng)和TLR信號通路變化的關(guān)系國內(nèi)外尚未見報道。為此，本文研究不同類型的小鼠實驗性結(jié)腸炎(分別類似人類的UC和CD的動物模型)Tim-1信號通路的變化及其與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和TLR信號通路的關(guān)系，并以此為干預靶點，分別觀察Tim-1信號通路對不同類型小鼠實驗性結(jié)腸炎的Treg細胞和TLR信號通路的影響，及其與疾病的的關(guān)系，從這一新的角度來探討IBD的發(fā)病機制，為IBD的防治提供新的靶點和方向。<

3、br>　　 方法：
　　 1.實驗分組
　　 (1)Tim-1抗體未處理小鼠組；(2)Tim-1抗體預處理小鼠組；
　　 每組內(nèi)再分為：①正常對照組；②DSS模型組；③TNBS模型組。
　　 2.小鼠實驗性結(jié)腸炎模型的建立
　　 (1)DSS誘導小鼠實驗性結(jié)腸炎模型的建立：BALB/c小鼠自由飲用5％DSS溶液7天，建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。
　　 (2)TNBS誘導小鼠實驗性結(jié)腸炎模型的

4、建立：BALB/C小鼠禁食、不禁飲24小時后，乙醚麻醉，用3.5F導管從肛門插入腸道深約5.5cm處，灌注TNBS/50％乙醇溶液100μl(含2mgTNBS的50％乙醇溶液)，之后將小鼠倒置60秒。從造模第一天開始，每日觀察并記錄各組小鼠體重、大便性狀，7天后處死小鼠。
　　 (3)小鼠Tim-1信號通路的干預：小鼠建模前12h，腹腔內(nèi)注射100μg抗-Fc抗體消除非特異性吸附后，再給予250μg抗-Tim-1Ab腹腔注射，對

5、照小鼠給予同等劑量的IgG2a。
　　 3.觀察以下各項指標：
　　 (1)各組小鼠每天的體重變化、結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(DAI積分)；
　　 (2)肉眼觀察小鼠結(jié)腸大體形態(tài)改變，HE染色觀察小鼠結(jié)腸炎病理組織學損傷程度；
　　 (3)Westernblot法檢測小鼠結(jié)腸組織中Foxp3、MyD88、SIGIRR、Tim-1蛋白的表達；
　　 (4)免疫組織化學染色檢測小鼠結(jié)腸組織中Foxp3、My

6、D88、SIGIRR、NF-kBp65蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組小鼠體重變化及DAI積分
　　 實驗第5、7天，各模型組小鼠體重下降百分比均顯著高于相應(yīng)的對照組(P<0.01)。在Tim-1抗體預處理組中，DSS組小鼠體重下降百分比顯著高于TNBS組(P<0.01)。小鼠體重變化在Tim-1抗體未處理組和預處理組之間有差異，僅實驗第7天DSS組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余組間差異無統(tǒng)計

7、學意義(P>0.05)。
　　 在實驗第5、7天，無論是Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，模型組小鼠DAI積分均顯著高于相應(yīng)對照組(P<0.01)。Tim-1抗體預處理的各組小鼠DAI積分均高于未處理組，但都無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 2.小鼠腸黏膜大體形態(tài)和結(jié)腸組織病理變化
　　 (1)無論是Tim-1抗體未處理組還是預處理組，對照組小鼠結(jié)腸黏膜呈淡紅色、光滑完整，未見充血、水腫、糜爛、潰瘍，DS

8、S組和TNBS組小鼠結(jié)腸黏膜可見充血、水腫、糜爛。
　　 (2)無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組，模型組小鼠的結(jié)腸炎癥程度、病變深度、隱窩破壞均顯著高于對照組(P<0.01)。Tim-1抗體預處理的各組小鼠病理組織學損傷程度均高于未處理組，但只有DSS組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.小鼠結(jié)腸組織中Foxp3的表達
　　 (1)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在Tim-1抗體未處理組中，模型組Foxp

9、3蛋白的表達低于對照組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在Tim-1抗體預處理組中，對照組Foxp3蛋白的表達顯著高于兩個模型組(P<0.01)。Foxp3蛋白表達在Tim-1抗體未處理組和預處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (2)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，對照組Foxp3陽性炎細胞數(shù)顯著高于模型組(P<0.01)。Tim-1抗體預處理的各模型組Foxp3陽性細胞數(shù)均低于

10、未處理小鼠，但只有DSS組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.小鼠結(jié)腸組織中SIGIRR的表達
　　 (1)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在Tim-1抗體未處理組中，對照組SIGIRR蛋白表達高于模型組(P<0.01，0.05)，DSS組高于TNBS組(P<0.05)。在Tim-1抗體預處理組中，對照組顯著高于DSS組(P<0.01)。SIGIRR蛋白的表達在Tim-1抗體未處理組和預處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0

11、.05)。
　　 (2)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，對照組SIGIRR蛋白的表達顯著高于模型組(P<0.01)。SIGIRR蛋白的表達在Tim-1抗體未處理組和預處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5.小鼠結(jié)腸組織中Myd88的表達
　　 (1)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，對照組Myd88蛋白的表達顯著低于模型組(P<0.0

12、1)，DSS顯著組高于TNBS組(P<0.01)。Myd88蛋白的表達在Tim-1抗體未處理組和預處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (2)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，對照組Myd88蛋白的表達顯著低于模型組(P<0.01)，在Tim-1抗體預處理組中，DSS組還顯著高于TNBS組(P<0.01)。同時Tim-1抗體預處理的各模型組MyD88的表達高于未處理組，但只有DSS組

13、間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 6.小鼠結(jié)腸組織中Tim-1的表達
　　 免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在Tim-1抗體未處理組中，對照組Tim-1蛋白的表達顯著高于模型組(P<0.01)；在Tim-1抗體預處理組中，對照組Tim-1蛋白表達均高于模型組，對照組和TNBS組之間有顯著差異(P<0.01)，但對照組和DSS組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，DSS組顯著高于TNBS組(P<0.05)。在對照組和DSS組

14、中，Tim-1抗體未處理組的Tim-1蛋白表達均顯著低于預處理組(P<0.01)。
　　 7.小鼠結(jié)腸組織中NF-kBp65的表達
　　 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論是在Tim-1抗體未處理組還是預處理組中，對照組NF-kBp65蛋白表達顯著低于兩個模型組(P<0.01)；在Tim-1抗體預處理組中，DSS組的表達還顯著高于TNBS組(P<0.05)。Tim-1抗體預處理的各模型組NF-kBp65表達均高于未處理組，但只有DS

15、S組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功的建立了DSS及TNBS誘導的實驗性結(jié)腸炎小鼠模型，并且Tim-1抗體預處理可加劇小鼠實驗性結(jié)腸炎的腸黏膜病變，提示了Tim-1信號通路參與了小鼠實驗性結(jié)腸炎的發(fā)病。
　　 2.Tim-1抗體預處理后小鼠實驗性結(jié)腸炎腸黏膜中。Foxp3蛋白表達降低，提示Tim-1抗體可能通過調(diào)控Treg細胞反應(yīng)來影響小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生。
　　 3.