TIM信號(hào)通路干預(yù)對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，它包括潰瘍性結(jié)腸炎（ Ulcerative Colitis, UC）和克羅恩?。–hron’sdisease, CD），IBD的發(fā)病率逐年上升，已成為一種全球性疾病，預(yù)測(cè)在未來(lái)10年，IBD患者將發(fā)生指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，中國(guó)將擁有超過(guò)150萬(wàn)的IBD患者。BD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物作用于基因易感

2、性宿主使之產(chǎn)生異常的免疫反應(yīng)在IBD腸道炎癥的起始和持續(xù)發(fā)展中起著重要的作用。
　　目前已明確，Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）信號(hào)通路在IBD免疫反應(yīng)異常中發(fā)揮重要作用，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。2001年McIntire發(fā)現(xiàn)了新的基因家族Tim（T cell Ig domain and mucin domain）家族，Tim基因家族蛋白對(duì)調(diào)控 T細(xì)胞的應(yīng)答起重要作用，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控

3、免疫異常的重要蛋白之一，是調(diào)節(jié)Th免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，并且與TLRs信號(hào)通路有密切關(guān)系。Tim-1主要表達(dá)在分化成熟的Th2細(xì)胞，Tim-4是Tim-1的天然配體，表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）表面；與Tim-1相反，Tim-3優(yōu)先表達(dá)于活化的 Th1細(xì)胞表面，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn) Tim-3少量表達(dá)于巨噬細(xì)胞（Macrophage， Mφ）、DC細(xì)胞等表面，半乳凝素-9（Galectin-9, Gal-9）是Tim-3

4、配體。因此，除了調(diào)節(jié)Th免疫，由于Tim-4及Tim-3可以表達(dá)于固有免疫細(xì)胞，而TLRs作為廣泛表達(dá)在固有免疫細(xì)胞中的受體，Tim蛋白是可以通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs信號(hào)通路而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)。目前，Tim相關(guān)研究主要集中在風(fēng)濕免疫性疾病及皮膚移植中，在炎癥性腸病的相關(guān)研究較少，Tim蛋白及其配體在 IBD發(fā)生發(fā)展中的作用，與Th免疫反應(yīng)及TLRs信號(hào)通路變化的關(guān)系目前尚不清楚。為此，本文通過(guò)體內(nèi)研究分別明確Tim-1配體Tim-4及Ti

5、m-3配體Gal-9對(duì)不同小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的腸道炎癥及TLR4信號(hào)通路的影響；通過(guò)體外研究明確Tim-3在巨噬細(xì)胞中的作用，及其對(duì)TLRs信號(hào)通路的影響；明確不同實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的腸道菌群結(jié)構(gòu)及Gal-9對(duì)腸道菌群的影響。旨在探討Tim配體干預(yù)在不同結(jié)腸炎模型中的作用及其調(diào)控機(jī)制，為臨床 IBD的防治尋找有效靶點(diǎn)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:
　?。ㄒ唬㏕im-1信號(hào)通路干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制
　　

6、（1）實(shí)驗(yàn)分組：50只Balb/c鼠隨機(jī)分為以下5組（每組10只）：
　?、僬?duì)照組（n=10）
　　② TNBS模型組（n=10）
　　③ TNBS+Tim-4組（n=10）
　?、?DSS模型組（n=10）
　　⑤ DSS+Tim-4組（n=10）
　?。?）實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立：
　　① TNBS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立：6～8周齡的Balb/c小鼠于禁食、不禁飲24小時(shí)后，用3

7、.5F導(dǎo)管從肛門(mén)插入腸道深約5.5cm，灌注TNBS/50％乙醇溶液100μl，之后將小鼠倒置60秒，于第8天處死小鼠。
　?、?DSS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立：6～8周齡的Balb/c小鼠自由飲用5%DSS溶液7天，于第8天處死小鼠。
　?。?）Tim-4干預(yù)方法：建模第3天開(kāi)始給予10ug Tim-4/0.4ml PBS腹腔內(nèi)注射，連續(xù)給藥5天；模型對(duì)照組小鼠給予0.4ml PBS腹腔注射。
　?。?）各項(xiàng)指

8、標(biāo)檢測(cè)：
　?、俑鹘M小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)DAI的變化
　?、?H&E染色觀察腸黏膜病理學(xué)變化及炎癥程度
　?、蹖?shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、Tim-1基因的表達(dá)
　?、苊庖呓M化法檢測(cè)腸黏膜內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB p65、Tim-1蛋白的表達(dá)
　?、?Wes全自動(dòng)蛋白分析檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、Tim-1蛋白的表達(dá)
　　⑥多重磁珠酶免分析法檢測(cè)血清中IL-1

9、β、IFN-γ及IL-6的含量
　?。ǘ㏕im-3信號(hào)通路干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制
　?。?）實(shí)驗(yàn)分組：50只Balb/c鼠隨機(jī)分為以下5組（每組10只）：
　　①正常對(duì)照組（n=10）
　?、?TNBS模型組（n=10）
　?、?TNBS+Gal-9組（n=10）
　　④ DSS組（n=10）
　?、?DSS+Gal-9組（n=10）
　?。?）實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立：同上

10、>　　（3）Gal-9干預(yù)方法：建模第3天開(kāi)始給予10ugGal-9/0.4ml去離子水腹腔內(nèi)注射，連續(xù)給藥5天；模型對(duì)照組小鼠給予0.4ml去離子水腹腔注射。
　?。?）各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)：
　　RT-PCR檢測(cè)Tim-3 mRNA表達(dá)
　　IHC及全自動(dòng)蛋白分析檢測(cè)Tim-3蛋白表達(dá)量
　　其余同上（不檢測(cè)Tim-1）
　　（三）Tim-3干擾對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響
　?。?）實(shí)

11、驗(yàn)分組：分為以下4組
　　①空白對(duì)照組：RAW264.7細(xì)胞
　?、?Tim-3干擾對(duì)照組：shRNA干擾Tim-3的RAW264.7細(xì)胞
　?、?LPS刺激組：RAW264.7細(xì)胞+LPS刺激
　　④ Tim-3干擾LPS刺激組：shRNA干擾Tim-3的RAW264.7細(xì)胞+LPS刺激根據(jù)以上分組，給予終濃度為100ng/ml的LPS作用24h（獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次）。
　?。?）檢測(cè)指標(biāo)：
　　We

12、s全自動(dòng)蛋白分析檢測(cè)細(xì)胞Tim-3、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表達(dá)
　　（四）小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化及Gal-9的干預(yù)影響
　　（1）實(shí)驗(yàn)分組：同第（二）部分
　?。?）收集各小鼠的新鮮糞便樣品，采用QIAamp DNA分離試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA
　?。?）將收集的DNA樣本送檢華大基因有限公司，擴(kuò)增目標(biāo)16S rRNA片段，混樣、純化、建庫(kù)后上機(jī)，基于Illumina Mis

13、eq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)V4可變區(qū)進(jìn)行雙末端測(cè)序，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬?Tim-1信號(hào)通路干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制
　　1．Tim-4干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎DAI的影響
　　TNBS及DSS模型組小鼠DAI均顯著高于正常組（P＜0.01），給予Tim-4干預(yù)后，TNBS及 DSS模型組 DAI仍顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01），TNBS+Tim-4組 DAI

14、有改善，但與未干預(yù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；而DSS+Tim-4組 DAI有上升趨勢(shì)，與未干預(yù)組差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　2．Tim-4干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜組織病理學(xué)及炎癥程度的影響
　　TNBS模型組小鼠的結(jié)腸炎癥程度、病變深度、隱窩破壞均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，小鼠病理組織學(xué)評(píng)分均有改善，隱窩破壞與正常組無(wú)顯著差異（p＞0.05），但炎癥程度及病變深度仍顯著高于

15、正常組（P＜0.01， P＜0.05），炎癥程度評(píng)分顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05）。無(wú)論有無(wú)Tim-4干預(yù)， DSS組小鼠結(jié)腸炎癥程度、病變深度、隱窩破壞均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；Tim-4干預(yù)后，病理組織學(xué)評(píng)分均有加重，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　3．Tim-4干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響
　?。?） Tim-4干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織Tim-1表達(dá)的影響
　

16、　RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，TNBS小鼠腸黏膜組織的 Tim-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；DSS模型組小鼠腸黏膜組織的Tim-1 mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。給予Tim-4干預(yù)處理后， TNBS組和DSS組Tim-1 mRNA表達(dá)升高，與正常組比較有顯著差異（P＜0.01）；兩模型組藥物干預(yù)前后的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　IHC結(jié)果顯示：在炎

17、細(xì)胞中，TNBS組及DSS組Tim-1表達(dá)均高于正常對(duì)照組，其中DSS組與正常對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，TNBS組Tim-1表達(dá)升高，而DSS組Tim-1蛋白表達(dá)下降，均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05， P＜0.01）；與Tim-4未干預(yù)組均有差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示：無(wú)論是TNBS模型還是DSS模型組，小鼠腸粘膜組織的Tim-1均高表達(dá)，顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；T

18、im-4干預(yù)后，TNBS模型組中Tim-1表達(dá)稍增高，而DSS組Tim-1下降明顯，與未干預(yù)組有明顯差異（P＜0.01），而與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。
　　（2） Tim-4干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織TLR4表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示：TNBS及DSS模型組小鼠腸黏膜組織的TLR4 mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。給予Tim-4干預(yù)處理后，TNBS模型組TLR4表達(dá)下調(diào)，且與

19、正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（p＞0.05）；DSS模型組TLR4表達(dá)仍有上調(diào)趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.01）；但兩模型組藥物干預(yù)前后mRNA表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　IHC結(jié)果顯示：無(wú)論有無(wú) Tim-4干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組TLR4表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，TNBS組TLR4表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05），而在DSS組TLR4蛋

20、白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，TNBS模型組及 DSS模型組結(jié)腸黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。給予Tim-4干預(yù)后，TNBS組TLR4表達(dá)下調(diào)，與未干預(yù)組有顯著差異（P＜0.01），而與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（p＞0.05）；DSS組TLR4上調(diào)明顯，與正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.01），而與未干預(yù)組差異無(wú)統(tǒng)

21、計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　?。?） Tim-4干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織MyD88表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示：TNBS及DSS模型組小鼠腸黏膜組織的MyD88 mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，TNBS組MyD88表達(dá)下調(diào)，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05），且與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（p＞0.05）；DSS模型組MyD88表達(dá)增加，顯著高于未干預(yù)組（P＜0.01），與正常對(duì)照組比較有

22、顯著差異（P＜0.01）。
　　IHC結(jié)果顯示：無(wú)論有無(wú) Tim-4干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組 MyD88表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，TNBS組MyD88表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05），而DSS組MyD88蛋白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，TNBS模型組結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋

23、白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；給予Tim-4干預(yù)后，TLR4表達(dá)下調(diào)，但與未干預(yù)組無(wú)顯著差異（p＞0.05）。與正常對(duì)照組相比，DSS模型組結(jié)腸黏膜組織MyD88蛋白表達(dá)升高（p＞0.05），但給予Tim-4干預(yù)后，MyD88上調(diào)明顯，與正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。兩組模型中，Tim-4干預(yù)前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）.
　?。?） Tim-4干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織NF-κB p65表達(dá)的影響：
　　IHC結(jié)

24、果顯示：無(wú)論有無(wú) Tim-4干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組NF-κBp65表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Tim-4干預(yù)后，TNBS組NF-κBp65表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05），而DSS組NF-κBp65蛋白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）
　　4．Tim-4干預(yù)對(duì)細(xì)胞因子釋放的影響
　　與正常對(duì)照組相比，TNBS模型及DSS模型小鼠血清中IFN-γ

25、、IL-6、IL-1β的釋放均有不同程度的增加；Tim-4干預(yù)后，TNBS組細(xì)胞因子釋放減少明顯，其中IFN-γ的釋放水平下調(diào)顯著（P＜0.01, P＜0.05），而DSS組細(xì)胞因子釋放較干預(yù)前有增加趨勢(shì)（p＞0.05）。
　　（二）Tim-3信號(hào)通路干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制
　　1．Gal-9干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎DAI的影響
　　TNBS及DSS模型組小鼠DAI均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），

26、給予Gal-9干預(yù)后，TNBS及DSS模型組DAI仍顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01）， TNBS+Gal-9組 DAI有改善，且第5天 DAI與未干預(yù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而DSS+Gal-9組DAI有上升趨勢(shì)，與未干預(yù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　2．Gal-9干預(yù)對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜組織病理學(xué)及炎癥程度的影響
　　TNBS模型組小鼠的結(jié)腸炎癥程度、病變深度、隱窩破壞均顯著高于正常對(duì)照

27、組（P＜0.01）。Gal-9干預(yù)后，小鼠病理組織學(xué)評(píng)分均有改善，隱窩破壞與正常組無(wú)顯著差異（p＞0.05），但炎癥程度及病變深度仍顯著高于正常組（P＜0.01），與未干預(yù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。無(wú)論有無(wú)Gal-9干預(yù)， DSS組小鼠結(jié)腸炎癥程度、病變深度、隱窩破壞均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；Gal-9干預(yù)后，病理組織學(xué)評(píng)分均有加重，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　

28、3．Gal-9干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響
　?。?）Gal-9干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織Tim-3表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，TNBS小鼠腸黏膜組織的 Tim-3 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DSS模型組小鼠腸黏膜組織的Tim-3 mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（p＞0.05）。給予Gal-9干預(yù)處理后，TNBS組和DSS組Tim-3 mRNA表達(dá)均升高

29、，與正常對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；TNBS模型組干預(yù)前后的Tim-3 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　IHC結(jié)果顯示：在炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組Tim-3表達(dá)均低正常對(duì)照組，其中TNBS組與正常對(duì)照組差異顯著（P＜0.01）。Gal-9干預(yù)后，TNBS組及DSS組Tim-3表達(dá)均升高，DSS組顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與Gal-9未干預(yù)組均有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

30、＜0.01）。
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示：TNBS模型組中結(jié)腸粘膜的Tim-3表達(dá)下降，給予Gal-9干預(yù)后，Tim-3上調(diào)，組間有顯著差異（P＜0.05）；DSS組的Tim-3表達(dá)無(wú)明顯變化，給予Gal-9干預(yù)后上調(diào)明顯，與正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。
　?。?）Gal-9干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織TLR4表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示：TNBS及DSS模型組小鼠腸黏膜組織的TLR4 mRNA表達(dá)均顯著高于

31、正常對(duì)照組（P＜0.05）。給予 Gal-9干預(yù)后，TNBS模型組 TLR4表達(dá)下調(diào)，且與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（p＞0.05）；DSS模型組TLR4表達(dá)仍有上調(diào)趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.01）；TNBS模型組藥物干預(yù)前后mRNA表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　IHC結(jié)果顯示：無(wú)論有無(wú) Gal-9干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組TLR4表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Gal-

32、9干預(yù)后，TNBS組TLR4表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.01），而在DSS組TLR4蛋白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示：與正常組相比，TNBS及 DSS模型組結(jié)腸黏膜組織的TLR4蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01, P＜0.05）；給予Gal-9干預(yù)處理后，TNBS組TLR4下調(diào)，而DSS組TLR4表達(dá)上調(diào)，與正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.01），但干預(yù)前后

33、組間無(wú)明顯差異。
　?。?）Gal-9干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織MyD88表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示：TNBS及DSS模型組小鼠腸黏膜組織的MyD88 mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。Gal-9干預(yù)后，TNBS組MyD88表達(dá)下調(diào)，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（p＞0.05），干預(yù)前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；DSS模型組MyD88表達(dá)增加，顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），干預(yù)前后

34、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　IHC結(jié)果顯示：無(wú)論有無(wú) Gal-9干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組MyD88表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。Gal-9干預(yù)后，TNBS組MyD88表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.05），而DSS組MyD88蛋白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）
　　Wes蛋白分析結(jié)果顯示： TNBS及DSS模型組結(jié)腸黏膜MyD88蛋白表達(dá)均

35、明顯上調(diào)（P＜0.05）；給予Gal-9干預(yù)處理后，TNBS組MyD88下調(diào)，干預(yù)前后組間有明顯差異（P＜0.05）。DSS模型組MyD88蛋白在Gal-9干預(yù)后上調(diào)明顯，與正常對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。
　?。?） Gal-9干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏膜組織NF-κB p65表達(dá)的影響：
　　IHC結(jié)果顯示：無(wú)論有無(wú) Gal-9干預(yù)，在腺細(xì)胞和炎細(xì)胞中，TNBS組及DSS組NF-κBp65表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）

36、。Gal-9干預(yù)后，TNBS組NF-κBp65表達(dá)下降，顯著低于未干預(yù)組（P＜0.01），而DSS組NF-κBp65蛋白表達(dá)仍有上升趨勢(shì)，但與未干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。
　　4．Gal-9干預(yù)對(duì)細(xì)胞因子釋放的影響
　　與正常對(duì)照組相比，TNBS及DSS模型小鼠血清中IFN-γ、IL-1β、IL-6的釋放有不同程度的增加。與未干預(yù)組相比，TNBS模型中細(xì)胞因子的釋放減少明顯，而DSS模型中細(xì)胞因子釋放有增加

37、，且IL-6升高明顯（P＜0.01）。
　?。ㄈ㏕im-3干擾對(duì)鼠源性巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路的影響
　　1．LPS對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)的影響
　　給予LPS刺激后，可見(jiàn)小鼠RAW264.7細(xì)胞的TLR4及MyD88mRNA有不同程度的升高，因此，LPS刺激可以激活巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以100ng/ml LPS作用24h進(jìn)行TLR4/NF-κB信號(hào)通路的蛋白檢測(cè)。

38、r>　　2．shRNA干擾Tim-3對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響
　　在LPS作用下，野生型巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88及pNF-κBp65蛋白表達(dá)在給藥后升高（P＜0.05）；shRNA干擾的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4及pNF-κBp65蛋白表達(dá)在給藥后顯著升高（P＜0.01），MyD88蛋白表達(dá)在給藥后稍升高（p＞0.05）。
　　在無(wú)LPS作用下，shRNA干擾組與野生型巨噬細(xì)胞組間TLR4、MyD88及p

39、NF-κBp65表達(dá)無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；在LPS作用下，shRNA干擾組TLR4及pNF-κBp65蛋白的表達(dá)顯著高于野生型巨噬細(xì)胞（P＜0.01），MyD88升高，但組間比較無(wú)差異（p＞0.05）；另外，在LPS作用下，野生型巨噬細(xì)胞內(nèi)Tim-3蛋白表達(dá)在LPS刺激后明顯降低（P＜0.01）。
　?。ㄋ模?shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸道菌群的變化及Gal-9的干預(yù)影響
　　1．實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化
　　TNB

40、S及DSS模型小鼠的腸道菌群均較正常組有變化。PCoA分析方法顯示正常對(duì)照組小鼠與兩組模型組腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異（ PC1貢獻(xiàn)度為24.59%，PC2貢獻(xiàn)度為11.55%）。與正常對(duì)照組相比，TNBS及DSS模型組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)中chao指數(shù)和shannon指數(shù)顯著下降而simpon指數(shù)升高，Alpha多樣性盒形圖顯示TNBS及DSS模型與正常組有差異，以DSS模型組差異更為顯著。在門(mén)的水平上，DSS模型組較對(duì)照組腸道菌群中

41、厚壁菌門(mén)減少，而TNBS模型組較對(duì)照組升高；且DSS組脫鐵桿菌門(mén)的平均豐度明顯高于正常組（P＜0.01）。在屬的水平上，與正常組比較，TNBS組的沃氏嗜膽菌屬（Bilophila）、Butyricimonas及Paraprevotella的相對(duì)豐度低于正常組，而瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、產(chǎn)堿菌屬（Coprococcus）的相對(duì)豐度高于正常組。DSS組的Parabacteroides、沃氏嗜膽菌屬（Bilophila）、Bu

42、tyricimonas、厭氧支原體屬（Anaeroplasma）的相對(duì)豐度低于正常組，而擬桿菌屬（Bacteroides）、Mucispirillum、螺桿菌屬（Helicobacter）、及Paraprevotella高于正常組。提示小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有不同的腸道菌群改變，且不同的腸道炎癥模型的菌群改變有不同。其中，胃球菌屬（Ruminococcus）增加是CD患者較特異的菌群失調(diào)改變。
　　2．Gal-9對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道菌

43、群結(jié)構(gòu)的影響
　　給予Gal-9干預(yù)后，TNBS及DSS模型小鼠腸道菌群的多樣性指數(shù)異常有改善，其中chao指數(shù)和shannon指數(shù)有升高，而simpson指數(shù)有下降。在門(mén)水平，用藥前后兩組細(xì)菌豐度無(wú)明顯差異（p＞0.05）；而在屬水平差異有顯現(xiàn)，給予Gal-9干預(yù)后的TNBS模型中，Odoribacter的相對(duì)豐度高于未給藥組（1.98%vs0.51%, P＜0.05）；給予Gal-9干預(yù)后的DSS造模中的顫螺旋菌屬（Oscil

44、lospira）的相對(duì)豐度高于未給藥組（6.42%vs4.04%）。
　　1. Tim-1配體Tim-4和Tim-3配體Gal-9干預(yù)，可影響小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的腸道炎癥和病情嚴(yán)重程度，且對(duì)不同結(jié)腸炎模型的作用不同。
　　2. Tim-1配體Tim-4和Tim-3配體Gal-9，可調(diào)節(jié)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，且對(duì)不同結(jié)腸炎模型的調(diào)控作用不同；這可能是其影響小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的腸道炎癥和病情嚴(yán)重程度的