殼聚糖-pUNO-mSIGIRR納米粒對小鼠實驗性結(jié)腸炎的治療作用及其機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 炎癥性腸病(IBD)的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚,已確認Toll樣受體(TLR)信號通路過度激活導致異常的免疫炎癥反應從中起重要作用,然而TLR信號通路過度激活的具體機制目前不明。SIGIRR是新近發(fā)現(xiàn)的TLR信號通路的負性調(diào)控因子,對TLR致炎信號通路有“剎車”作用,可減輕炎癥反應,但作用機制不詳。有研究表明SIGIRR在IBD表達低下,但是SIGIRR在。IBD發(fā)病中的作用機制及它可否抑制IBD時TLR信

2、號通路的過度激活、減輕炎癥反應,尚無研究報道。殼聚糖納米粒是一種無毒的基因傳輸載體材料。為此,本研究在小鼠實驗性結(jié)腸炎模型中研究了SIGIRR和TLR信號通路變化及它們的相互關系,并運用新型基因輸送載體殼聚糖納米粒裝載編碼SIGIRR的外源性基因腸道給藥,觀察它對小鼠實驗性結(jié)腸炎TLR信號通路的影響,闡明SIGIRR對IBD是否有治療作用及其可能的機制,為IBD的治療提供新的靶點和方向。
　　 方法：
　　 1.殼聚糖/

3、pUNO-mSIGIRR和殼聚糖/pUNO納米粒的制備:
　　 ①用質(zhì)粒提取試劑盒提取pUNO-mSIGIRR和pUNO質(zhì)粒:
　　 ②采用復凝聚法制備殼聚糖納米粒,根據(jù)影響納米粒制備的殼聚糖溶液濃度、pH值、質(zhì)粒DNA濃度、Na2SO4濃度及渦旋時間五個因素,優(yōu)化制備條件。
　　 ③用透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)；納米粒度儀測量納米粒的粒徑；用熒光光度分光計測定混懸液中游離DNA的量,并計算其包裹率。

4、　　 2.實驗分組:
　　 ①對照組:未建模的小鼠僅給予生理鹽水灌腸；
　　 ②模型組:建模的小鼠僅給予生理鹽水灌腸；
　　 ③空質(zhì)粒組:建模的小鼠給予全量殼聚糖/pUNO納米粒灌腸；
　　 ④半量組:建模的小鼠給予用生理鹽水等體積稀釋的殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米粒灌腸；
　　 ⑤全量組:建模的小鼠給予全量殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米粒灌腸。每組7只小鼠,每次0.1ml灌腸。<

5、br>　　 3.DSS誘導小鼠結(jié)腸炎模型的建立和藥物治療:
　　 BALB/c小鼠自由飲用5％DSS溶液7天,建立小鼠急性結(jié)腸炎模型,模型建立成功標志為:體重下降、腹瀉、大便隱血陽性或肉眼血便中的任一癥狀。將未造模的僅給予生理鹽水灌腸的小鼠作為對照組。在造模第2天開始,分別按上述分組的藥物劑量給藥,每天1次,直至實驗結(jié)束。處死小鼠,取標本待測。
　　 4.各項指標的觀察和檢測:
　　 ①觀察每天各組小鼠體重、疾

6、病活動指數(shù)DAI；
　　 ②肉眼觀察小鼠結(jié)腸大體形態(tài)改變,HE染色觀察病理組織學改變:
　　 ③RT-PCR方法檢測小鼠結(jié)腸組織中SIGIRR mRNA的表達；
　　 ④免疫組織化學染色檢測小鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、SIGIRR和NF-κBp65蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.殼聚糖納米粒的制備及理化性質(zhì)研究
　　 根據(jù)影響殼聚糖/pUNO-mSIGIRR和殼聚糖/pUNO

7、納米粒制備的因素,得到的優(yōu)化條件為:殼聚糖濃度、PH值、質(zhì)粒DNA濃度、NaSO4濃度、渦旋時間分別為300ug/ml、5.5、100ug/ml、8 mM、30sec。用此條件制備得到的納米粒:①用透射電子顯微鏡觀察了納米粒的形態(tài),大多數(shù)納米粒呈球形,形態(tài)比較規(guī)則,且絕大多數(shù)粒子的直徑在100nm以下:②用納米粒度儀測定了殼聚糖/pUNO-mSIGIRR的ZAve平均徑、強度平均徑、數(shù)目平均徑、體積平均徑及多分散度,結(jié)果分別為213.8

8、nm、215.8nm、80.43nm、104nm和0.466。殼聚糖/pUNO納米粒的測定結(jié)果分別為:269.6nm、366.6nm、67.74nm、450.4nm和0.251；③用熒光光度分光計測定混懸液中游離DNA的含量,計算包裹率為99.9％。
　　 2.殼聚糖/pUNO-mSIGIRR對小鼠實驗性結(jié)腸炎的治療作用及其機制研究
　　 (1)小鼠體重及DAI積分變化
　　 ①除對照組外各組小鼠在造模后體重開始

9、下降,實驗第5天體重下降至最低點,隨后逐漸回升。在實驗第5、10天模型組和各藥物組體重下降百分比均高于對照組(P<0.001,0.05)；在實驗第5天和第10天半量和全量組小鼠體重下降均低于模型組和空質(zhì)粒組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),半量和全量組問差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 ②各組小鼠DAI積分在實驗第5、10天有顯著差異,對照組的DAI積分顯著低于模型組和各藥物組(P<0.001)；實驗第5天半量組和全量組

10、顯著低于模型組(P<0.05),半量和全量組低于空質(zhì)粒組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在實驗第10天半量組和全量組低于模型組和空質(zhì)粒組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (2)小鼠結(jié)腸病理學改變
　　 ①小鼠腸黏膜大體形態(tài):對照組小鼠結(jié)腸黏膜未見充血、水腫、糜爛和潰瘍,模型組和空質(zhì)粒組可見結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫和糜爛；半量及全量組結(jié)腸黏膜充血、水腫和糜爛較模型組及空質(zhì)粒組明顯改善。
　　 ②小鼠結(jié)腸病理

11、組織學嚴重度評分:無論是結(jié)腸炎癥程度、病變深度和隱窩破壞,對照組均顯著低于模型組及各藥物組(P<0.001,0.005,0.05)；半量及全量組均顯著低于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.01,0.05),半量和全量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (3)小鼠結(jié)腸黏膜SIGIRR表達
　　 SIGIRR mRNA的表達:對照組顯著高于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.05),半量和全量組顯著高于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.0

12、01,0.05),半量和全量組較對照組升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),全量組較半量組升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SIGIRR蛋白在腺細胞中表達:對照組顯著高于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.001),半量和全量組顯著高于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.001),半量和全量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (4)小鼠結(jié)腸黏膜TLR4表達
　　 TLR4蛋白在腺細胞中表達:對照組顯著低于模型組和空質(zhì)粒組(P

13、<0.001),半量和全量組顯著低于模型組(P<0.05),全量組顯著低于空質(zhì)粒組(P<0.05)。TLR4蛋白在炎細胞中的表達:對照組顯著低于模型組和各藥物組(P<0.001,0.01),半量和全量組顯著低于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.05),半量和全量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (5)小鼠結(jié)腸黏膜MyD88表達
　　 MyD88蛋白在腺細胞和炎細胞中表達:對照組顯著低于模型組和各藥物組(P<0.00

14、1,0.05),半量和全量組顯著低于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.001,0.05),半量和全量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (6)小鼠結(jié)腸黏膜NF-κB p65表達NF-κB p65蛋白在炎細胞中表達:對照組顯著低于模型組和各給藥組(P<0.001,0.05),半量和全量組顯著低于模型組和空質(zhì)粒組(P<0.001,0.05),半量和全量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

15、1.本研究運用復凝法制備的殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米粒其ZAve平均徑、強度平均徑、數(shù)目平均徑、體積平均徑、多分散度和包裹率符合基因治療載體的要求。
　　 2.本研究制備的殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米粒經(jīng)腸道給藥后,小鼠腸黏膜SIGIRR mRNA和蛋白的表達較模型組和空質(zhì)粒組升高,提示SIGIRR基因進入細胞并表達,說明殼聚糖納米粒可作為基因輸送載體用于基因治療。
　　 3.DSS誘導的實驗性結(jié)腸炎小

16、鼠腸黏膜SIGIRR的表達降低,TLR4、MyD88、NF-KB p65表達增加,提示TLRs/NF-κB信號通路過度活化和它的負性調(diào)控機制的減弱參與了IBD的致病。
　　 4.殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米?？蓽p輕實驗性結(jié)腸炎小鼠的癥狀、腸黏膜炎癥和病理損傷,有望成為治療IBD的新途徑。
　　 5.殼聚糖/pUNO-mSIGIRR納米?？上抡{(diào)實驗性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表達,