吡格列酮對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的： 吡格列酮是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ的配體，近年來(lái)研究表明PPAR-γ是治療炎癥性腸病（IBD）的潛在靶點(diǎn)，它經(jīng)配體激活后通過(guò)抑制NF-κB的活化，減少促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而下調(diào)過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)。TLRs信號(hào)通路的激活可活化NF-κB，從而誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，這在IBD的發(fā)病中起重要作用。然而在IBD發(fā)病中抗炎的PPAR-γ信號(hào)通路和促炎的TLRs信號(hào)通路之間的相互關(guān)系目前所知甚少。為此

2、本文觀察了吡格列酮對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用，以及在這一過(guò)程中PPAR-γ，TLRs信號(hào)通路的重要因子TLR2、TLR4、MyD88、TLRs信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控因子SIGIRR、NF-κB的活化標(biāo)志物NF-κB p65的表達(dá)變化，研究PPAR-γ信號(hào)通路和TLRs信號(hào)通路在IBD中的相互關(guān)系，從一新的角度探討吡格列酮對(duì)IBD的作用機(jī)制。 方法： （1）實(shí)驗(yàn)分組： ①對(duì)照組：未建模的小鼠僅給予藥物賦形劑

3、0.5％CMC；②模型組：建模的小鼠僅給予藥物賦形劑0.5％CMC；③柳氮磺胺吡啶（SASP）組：建模的小鼠給予100mg/kgSASP+0.5％CMC；④吡格列酮高劑量（PG1）組：建模的小鼠給予100mg/kg吡格列酮+0.5％CMC；⑤吡格列酮中劑量（PG2）組：建模的小鼠給予50mg/kg吡格列酮+0.5％CMC；⑥吡格列酮低劑量（PG3）組：建模的小鼠給予25mg/kg吡格列酮+0.5％CMC。每組10只小鼠。 （2）

4、DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型的建立和藥物治療： BALB/c小鼠自由飲用3％DSS溶液7天，然后停止飲用DSS溶液改用蒸餾水10天，建立小鼠慢性結(jié)腸炎模型，模型建立成功標(biāo)志為有半稀便、腹瀉、大便隱血陽(yáng)性和肉眼血便中的任一癥狀。將飲用蒸餾水的小鼠作為對(duì)照組。在造模第2天開(kāi)始分別按上述分組的藥物劑量灌胃，每天1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。處死小鼠，取標(biāo)本待測(cè)。實(shí)驗(yàn)共18天。 （3）各項(xiàng)指標(biāo)的觀察和檢測(cè)： ①觀察每天各組小鼠體重、疾

5、病活動(dòng)指數(shù)DAI；②肉眼觀察小鼠結(jié)腸大體形態(tài)改變，HE染色觀察病理組織學(xué)改變；③RT-PCR方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4、MyD88、SIGIRR和PPAR-γ mRNA的表達(dá)；④免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： （1）小鼠體重和DAI積分改變 ①除對(duì)照組外各組小鼠在實(shí)驗(yàn)第5天體重顯著下降，在第10天及第15天體重體重逐漸回升。在

6、實(shí)驗(yàn)第5、10、15天模型組和各藥物組體重下降百分比均高于對(duì)照組（P<0.001，0.005，0.05）；在實(shí)驗(yàn)第5天SASP組和吡格列酮高、低劑量組體重下降百分比均低于模型組（P<0.05），在實(shí)驗(yàn)第10天吡格列酮低劑量組體重下降百分比均于模型組和SASP組（P<0.05），在實(shí)驗(yàn)第15天SASP組體重下降百分比顯著低于模型組和吡格列酮中劑量組（P<0.05），吡格列酮高劑量組體重下降百分比低于模型組和吡格列酮中、低劑量組（P<0.0

7、5，0.005，0.001）。 ②各組小鼠DAI積分在實(shí)驗(yàn)第5、10天有顯著差異，對(duì)照組的DAI積分顯著低于模型組和各藥物組（P<0.001）；實(shí)驗(yàn)第5天SASP組和吡格列酮高劑量組顯著低于模型組（P<0.001，0.05），吡格列酮高劑量組顯著低于吡格列酮中劑量組（P<0.05）；在實(shí)驗(yàn)第10天吡格列酮低劑量組顯著低于模型組、SASP組和吡格列酮中劑量組（P<0.05）。在實(shí)驗(yàn)第15天各組小鼠DAI積分雖有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P>0.05）。 （2）小鼠結(jié)腸病理學(xué)改變 ①小鼠腸黏膜大體形態(tài)：正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜無(wú)充血、水腫，模型組可見(jiàn)明顯結(jié)腸黏膜充血、水腫，SASP組和吡格列酮組結(jié)腸黏膜充血、水腫較模型組輕；各組結(jié)腸肉眼觀察均未見(jiàn)明顯的潰瘍和糜爛。 ②小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)嚴(yán)重度評(píng)分：無(wú)論是結(jié)腸炎癥程度、病變深度還是隱窩破壞程度在正常對(duì)照組均顯著低于其它各組（P<0.001，0.005）；在SASP和吡格列酮高、中劑量組均顯著低于模型

9、組（P<0.001，0.005，0.05）；炎癥程度在吡格列酮高劑量組還顯著低于吡格列酮低劑量組（P<0.05）。 （3）小鼠結(jié)腸黏膜TLR2表達(dá)：TLR2 mRNA的表達(dá)在各組小鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)無(wú)顯著差異（P>0.05）；但是，TLR2蛋白的表達(dá)在正常對(duì)照組顯著低于模型組和各藥物組（P<0.001），在SASP組和吡格列酮高、中劑量組顯著低于模型組（P<0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

10、>0.05）。 （4）小鼠結(jié)腸黏膜TLR4表達(dá)：TLR4 mRNA的表達(dá)在模型組顯著高于對(duì)照組和各藥物組（P<0.001，0.01），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且各藥物組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）；TLR4蛋白的表達(dá)在正常對(duì)照組顯著低于模型組和各藥物組（P<0.001，0.005），在SASP組和吡格列酮高、中劑量組顯著低于模型組（P<0.01，0.05），在吡格

11、列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，高劑量組顯著低于低劑量組（P<0.05）。 （5）小鼠結(jié)腸黏膜MyD88的表達(dá)：MyD88 mRNA的表達(dá)在模型組顯著高于對(duì)照組、SASP組和吡格列酮高劑量組（P<0.001，0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且各藥物組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。MyD88蛋白的表達(dá)在正常對(duì)照組顯著低于模型組和各藥物組（P<0.001

12、），在SASP組和吡格列酮高、中劑量組顯著低于模型組（P<0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 （6）小鼠結(jié)腸黏膜SIGIRR mRNA的表達(dá)：SIGIRR mRNA的表達(dá)在對(duì)照組顯著高于模型組、SASP組和吡格列酮低、中劑量組（P<0.005，0.01，0，05），各藥物組與模型組無(wú)顯著差異（P>0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

13、P>0.05）。 （7）小鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ mRNA的表達(dá)：PPAR-γ mRNA的表達(dá)在對(duì)照組顯著高于模型組和吡格列酮低、中劑量組（P<0.005，0.01，0.05），在SASP組顯著高于模型組（P<0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 （8）小鼠結(jié)腸黏膜NF-κB p65蛋白的表達(dá)：NF-κB p65蛋白的表達(dá)在正常對(duì)照組顯著低于模型組和各藥物組（P<0

14、.001，0.005，0.01），在SASP組和吡格列酮高劑量組顯著低于模型組（P<0.05），在吡格列酮低、中、高劑量各組，呈劑量依賴(lài)地下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論： （1）DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜PPAR-γ和SIGIRR的表達(dá)降低，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)增加，提示TLRs/NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活和它的負(fù)性調(diào)控機(jī)制的減弱及PPAR-γ信號(hào)通路的抑制參與了I

15、BD的致病。 （2）PPAR-γ配體吡格列酮可減輕小鼠結(jié)腸的癥狀和病理組織的炎癥和損傷，有望成為治療IBD的新途徑。 （3）給予吡格列酮后小鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB p65的表達(dá)顯著下降，并與結(jié)腸炎癥的緩解有關(guān)，提示PPAR-γ配體可能通過(guò)抑制TLRs/NF-κB的激活減輕組織炎癥反應(yīng)。 （4）給予吡格列酮后小鼠結(jié)腸組織中SIGIRR和PPAR-γ的表達(dá)有劑量依賴(lài)性上調(diào)，提示PPAR