雷公藤多苷殼聚糖微球的制備及其對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎作用的研究.pdf

1、目的與背景：
　　雷公藤多苷（Tripterygium Glycosides，TG）作為一種免疫抑制劑，具有強(qiáng)大抗炎和抗免疫作用。雖然炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，但研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）/NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活對(duì)IBD的發(fā)生起著重要作用。雷公藤多苷作為一種免疫抑制劑能否通過(guò)抑制 TLRs/NF-κB信號(hào)

2、通路的過(guò)度激活來(lái)減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，此方面還有待研究。因此，本課題首先制備雷公藤多苷殼聚糖微球并包裹丙烯酸樹(shù)脂，使雷公藤多苷能在結(jié)腸處定位釋放，降低雷公藤多苷的不良反應(yīng)；其次構(gòu)建葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，通過(guò)觀察雷公藤多苷殼聚糖微球?qū)ζ涞闹委熥饔?，研究雷公藤多苷?duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎TLRs/NF-κB信號(hào)通路的影響，探討可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1、

3、制備雷公藤多苷殼聚糖微球和檢測(cè)其體外釋放
　　通過(guò)復(fù)乳-乳化交聯(lián)的方法來(lái)制備雷公藤多苷殼聚糖微球，選用載藥率、包封率和粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)初乳與油相之比、殼聚糖的濃度、交聯(lián)劑的用量以及攪拌速度來(lái)設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)的制備工藝，根據(jù)最優(yōu)工藝制備微球并在其外面包裹丙烯酸樹(shù)脂；通過(guò)掃描電鏡觀察微球的形態(tài)，顯微鏡觀察粒徑分布，采用高效液相色譜法分析微球的包封率和載藥率，并測(cè)定微球的體外釋放度。
　　2、雷公藤多苷殼聚糖微球

4、對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用
　　2.1模型建立：正常對(duì)照組小鼠自由飲用干凈的飲用水；其余各處理組小鼠自由飲用葡聚糖硫酸鈉溶液（5％）7天，構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的模型。
　　2.2實(shí)驗(yàn)分組：90只BALB/c小鼠隨機(jī)分成10組：正常對(duì)照組（N組）；DSS模型組（M組）；柳氮磺吡啶組（SASP組）；空殼聚糖微球組（C組）；雷公藤多苷高、中、低劑量組（HTG、MTG、LTG組）；雷公藤多苷微球高、中、低劑量組（HTGM、MTGM、L

5、TGM組）。N組和M組的小鼠每天灌胃0.5%CMC溶液，SASP組每天灌胃100mg/kgSASP的CMC溶液，C組的每天灌胃120mg/kg空殼聚糖微球的CMC溶液；HTG、MTG、LTG組小鼠每天灌胃40mg/kg、20mg/kg、10mg/kgTG的CMC溶液；HTGM、MTGM、LTGM組240mg/kg、120mg/kg、60mg/kgTGM的CMC溶液；造模第1天開(kāi)始，按上述灌胃處理每天1次，每次0.2mL，7天后留取血和結(jié)

6、腸組織。
　　2.3各項(xiàng)指標(biāo)的觀察和檢測(cè)：①每天觀察小鼠的體重變化、大便性狀和隱血情況，計(jì)算各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分；②HE染色法檢測(cè)小鼠病理組織學(xué)變化；③Western blotting檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4、MyD88蛋白；④免疫組化檢測(cè)MyD88、TLR4和NF-κB p65在結(jié)腸中的表達(dá)水平；⑤ELISA法檢測(cè)血清中IL-6的含量。
　　結(jié)果：
　　1、制備雷公藤多苷殼聚糖微球和檢測(cè)其體外釋放

7、　　制備雷公藤多苷殼聚糖微球的最優(yōu)處方工藝為：殼聚糖濃度為15mg/mL，初乳與油相之比為1∶15，交聯(lián)劑的用量為4 mL，攪拌速度為600r/min。通過(guò)最優(yōu)工藝制備的雷公藤多苷殼聚糖微球形態(tài)良好、大小均勻，平均載藥量為17.12%±1.74，平均包封率為54.97%±4.10，平均粒徑為7.16±2.10μm；在體外釋放試驗(yàn)中，沒(méi)有包腸衣的微球在人工胃液pH1.2、人工胃腸混合液pH4.8和人工腸液pH6.8中基本釋放完全；包裹腸衣

8、的微球在人工胃液pH1.2和人工胃腸混合液pH4.8基本沒(méi)有釋放，在人工腸液pH6.8釋放不到10%，在人工大腸液pH7.4的累計(jì)釋放率約為60%，而在加入大鼠結(jié)腸內(nèi)容物的人工大腸液中，腸衣微球的累計(jì)釋放率可以達(dá)到70%。該微球的形態(tài)、包封率和載藥率良好，體外釋放符合結(jié)腸定位給藥的要求。
　　2、雷公藤多苷殼聚糖微球?qū)π∈髮?shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用
　　2.1小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及DAI積分變化：造模2天后，造模各組小鼠出現(xiàn)體重減輕，活

9、動(dòng)減少，飲食減少，大便松散等現(xiàn)象，DAI評(píng)分開(kāi)始上升；到實(shí)驗(yàn)第5天，SASP組、TG組和TGM組小鼠的狀態(tài)與M組比較有明顯改善，DAI評(píng)價(jià)也較M組明顯降低，但高于N組。M組和C組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度與N組比較明顯縮短（P＜0.05）；與M組比較，TG高、中劑量組和TGM高、中劑量組的長(zhǎng)度均較長(zhǎng)，有顯著差異（P＜0.05）；給藥劑量相等的條件下，TG組的長(zhǎng)度比TGM組的短，但沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。
　　2.2結(jié)腸組織HE染色評(píng)分：與

10、N組比較，各建模組小鼠的結(jié)腸組織有明顯的病理學(xué)損傷（P＜0.01）；SASP組、TG組和TGM組的HE評(píng)分顯著低于M組（P＜0.05,0.01）；TG組和TGM組均有一定的劑量依賴性，相同給藥劑量下，TGM組評(píng)分低于TG組。
　　2.3結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達(dá)：與N組比較，M組和C組的結(jié)腸組織表達(dá)TLR4、MyD88、NF-κB p65明顯增高（P＜0.01）；與M組比較，SASP、HTG、MT

11、G和TGM各組的表達(dá)均下降（P＜0.01）；在TG和TGM組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達(dá)隨著劑量增加而下降，且低劑量組的表達(dá)均顯著高于高劑量組（P＜0.01）；在相同劑量的下，TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白在TGM組比TG組中水平低（P＜0.05）。
　　2.4血清中IL-6的表達(dá)：在M組小鼠的血清中，IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；在TG各組和TGM各組中，IL-6的水平均降低，隨著給

12、藥劑量的增大明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、本研究制備的雷公藤多苷殼聚糖微球狀態(tài)良好，符合結(jié)腸定位釋放的要求。
　　2、在模型組中，MyD88、TLR4、NF-κB p65在小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)明顯增高，IL-6在血清中的含量明顯增高，提示TLRs/NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活與IBD致病有聯(lián)系。
　　3、雷公藤多苷和雷公藤多苷微球均能減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的癥狀，改善結(jié)腸組織的病理?yè)p傷，降低MyD88、TLR4、NF