粒細(xì)胞型髓源抑制細(xì)胞在哮喘患者外周血水平及體外誘導(dǎo)分化機(jī)制研究.pdf

1、髓源抑制細(xì)胞(MDSCs)由不成熟巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等髓系細(xì)胞組成，其對T細(xì)胞功能有很強(qiáng)抑制作用。MDSCs可分為兩種表型:粒細(xì)胞型(G-MDSCs)和單核細(xì)胞型(M-MDSCs)，兩者在細(xì)胞增殖及免疫抑制功能機(jī)制上不盡相同。前期研究在哮喘動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs參與了哮喘發(fā)生與發(fā)展。在給哮喘小鼠過繼轉(zhuǎn)移脂多糖誘導(dǎo)的不同表型MDSCs發(fā)現(xiàn):G-MDSCs能減輕氣道炎癥。那么，G-MDSCs在哮喘急性期及臨床緩解期患者外周血分布

2、情況如何？是否與哮喘氣道炎癥的發(fā)生有關(guān)？本研究在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步探討其在哮喘患者外周血所占比例情況，為G-MDSCs作為哮喘急性發(fā)作臨床指標(biāo)做初步探索。近來，MDSCs因可進(jìn)行體內(nèi)誘導(dǎo)、體外擴(kuò)增、自體和異體移植而日益成為免疫治療關(guān)注的熱點(diǎn)，但體外誘導(dǎo)效率較低及較難獲得單一表型MDSCs大大限制其臨床應(yīng)用。課題組前期雖已成功用LPS體內(nèi)誘導(dǎo)MDSCs生成，但誘導(dǎo)成功后需進(jìn)一步分離提純，步驟復(fù)雜。如前所述，已經(jīng)探討G-MDSCs

3、與哮喘小鼠氣道炎癥關(guān)系及其在哮喘患者外周血情況。那么，為了進(jìn)一步闡明其在哮喘中的作用，并用于哮喘等免疫性疾病的治療，建立高效G-MDSCs體外誘導(dǎo)體系值得研究。因此，本研究擬采用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)體外定向誘導(dǎo)G-MDSCs，尋找體外誘導(dǎo)純化的最佳條件，同時(shí)探索誘導(dǎo)信號通路，為建立有效的G-MDSCs誘導(dǎo)體系及推進(jìn)其臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　第一部分 G-MDSCs在哮喘患者外周血水平觀察
　　目的:研究哮喘患者外

4、周血MDSCs及其不同表型G-MDSCs和M-MDSCs所占比例情況。
　　方法:收集就診于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院33例哮喘急性期患者，16例緩解期哮喘患者和15例健康對照者外周靜脈血5ml;將血標(biāo)本處理后用抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測MDSCs及其不同表型所占比例。
　　結(jié)果:1.三組FeNO、PEF、MMEF％pred、MEF75％pred和MEF50％pred差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　2.MDSCs占外

5、周血單個(gè)核細(xì)胞比例在急性期哮喘組中最高，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，而G-MDSCs及M-MDSCs所占比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P＞0.05)。
　　3.各組G-MDSCs所占比例均高于M-MDSCs，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　結(jié)論:MDSCs占外周血單核細(xì)胞比例在急性期哮喘組最高，而其不同表型并無差異。G-MDSCs在哮喘患者或是正常人中均為主要表型。
　　第二部分 G-MDSCs體外誘導(dǎo)

6、分化條件及免疫抑制功能研究
　　目的:探討G-CSF體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞定向分化成G-MDSCs適宜條件及其對T細(xì)胞免疫抑制功能研究。
　　方法:于BALB/c小鼠無菌獲取骨髓細(xì)胞，利用GM-CSF聯(lián)合不同濃度梯度G-CSF，加或不加脂多糖(LPS)體外刺激骨髓細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)用流式檢測MDSCs及其不同表型所占比例;用不同濃度GM-CSF加或不加G-CSF刺激骨髓細(xì)胞，流式檢測G-MDSCs比例;用誘導(dǎo)分化MDSCs與CFS

7、E標(biāo)記淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，流式檢測淋巴細(xì)胞增殖率。
　　結(jié)果:1.隨G-CSF濃度增加，G-MDSCs所占比例明顯增加，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，G-CSF(50ng/ml)為最適濃度，且第5天增多最為明顯（均P＜0.001）。
　　2.G-CSF聯(lián)合LPS組G-MDSCs比例較無LPS組減少(均P＜0.05)。
　　3.MDSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)組較無MDSCs組T細(xì)胞增值率下降（均P＜0.05）。

8、>　　結(jié)論:G-CSF體外可誘導(dǎo)MDSCs生成，且促進(jìn)G-MDSCs表型分化，50ng/mlG-CSF刺激時(shí)間5天為適宜誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)生成的MDSCs具有免疫抑制功能。
　　第三部分 G-CSF體外定向誘導(dǎo)G-MDSCs信號通路機(jī)制研究
　　目的:探討G-CSF體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞定向分化成G-MDSCs信號通路。
　　方法:不同濃度梯度G-CSF(0，5，10，50，100ng/ml)刺激骨髓細(xì)胞，3-5天后收集細(xì)胞，分

9、別提取核酸及蛋白，用RT-PCR和Western blot檢測STAT3、C/EBPβ表達(dá)量。
　　結(jié)果:1.STAT3和C/EBPβmRNA表達(dá)情況:各組STAT3mRNA表達(dá)量無明顯區(qū)別(P=0.24)，C/EBPβ在各組表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），除5ng/ml組以外，其余較對照組均有顯著增加，50ng/ml組最明顯(P＜0.001，P＜0.001，P=0.003和P=0.001)。
　　2.STAT3和

10、C/EBPβ蛋白表達(dá)情況:總STAT3在各組無明顯差異(P=0.739)，p-STAT3隨劑量增加而上升，其中50ng/ml組最顯著（均P＜0.001）。C/EBPβ及p-C/EBPβ在各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018和P=0.03），50ng/ml組升高最為明顯。
　　結(jié)論:p-STAT3與p-C/EBPβ表達(dá)量隨濃度增高增加，且兩者變化趨勢相同，G-CSF可能是通過STAT3/C/EBPβ信號通路調(diào)控G-MDSCs定向分