肌源性干細(xì)胞的表型研究及體外誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從新西蘭兔肌肉中分離出MDSC加以鑒定，并將其誘導(dǎo)為平滑肌細(xì)胞，研究其表形特征及探索其分化特性。 研究材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)動物：新西蘭大白兔，雌雄不限，體重約1.5～2.0Kg，月齡1～1.5個(gè)月。 2.實(shí)驗(yàn)試劑與器材：小鼠抗α平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMactin，α-SMA)、小鼠抗desmin、小鼠抗skeletalmyosin(fast)、小鼠抗vimentin、FITC-羊抗小鼠IgG、Cy3-

2、羊抗小鼠IgG、ⅩⅠ型膠原酶；馬血清(HS)、DMEM-LG、Trypsin；dispase；胎牛血清；兔抗GAPDH；BCA-100蛋白定量測定試劑盒；二抗曝光試劑盒。流式細(xì)胞儀、超凈臺、顯微外科器械等。 3.MDSC的分離、培養(yǎng)、鑒定及其融合特性檢測：利用Preplate技術(shù)分離MDSC：無菌條件下取得新西蘭兔的臀肌并剪成肉泥，依次使用Ⅺ型膠原酶、dispase及胰酶對組織進(jìn)行消化，得到的細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，此為PP1；細(xì)

3、胞培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后將PP1中的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP2；隨后每24小時(shí)將懸液轉(zhuǎn)移至膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP3～PP6。PP6中相當(dāng)大部分即為MDSC。收集PP6細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測其desmin、CD45及Bcl-2陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測desmin表達(dá)；利用WesternBlotting檢測PP1～PP6中α-SMA的表達(dá)趨勢。在高匯合度或低血清濃度培養(yǎng)基的條件下檢測MDSC的融合傾

4、向。 4.MDSC體外誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究：誘導(dǎo)分化采用共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系和直接誘導(dǎo)體系。 (1)共培養(yǎng)誘導(dǎo)：細(xì)胞用Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核的標(biāo)記，接種至六孔板，每孔內(nèi)加入等量的兔海綿體平滑肌細(xì)胞(CSMC)進(jìn)行共培養(yǎng)，2天后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測α-SMA表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置未處理組以及陽性對照組。 (2)直接誘導(dǎo)：細(xì)胞接種到六孔板后添加含25ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2天

5、后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)以及WB法檢測α-SMA表達(dá)情況。同時(shí)另設(shè)一未處理組，陰性對照組以及陽性對照組。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Preplate技術(shù)分離的細(xì)胞中PP1和PP2貼壁細(xì)胞相對較少，PP3開始即有大量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，這些小體積細(xì)胞數(shù)量到PP6時(shí)增至80％。它們極易融合，生長呈方向性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示PP6細(xì)胞的desmin、CD45以及Bcl-2的陽性率平均為83.10±0.16％、0.79±0.03％及79.90

6、±0.20％。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可見較多的desmin陽性細(xì)胞。WesternBlotting顯示PP6不表達(dá)α-SMA。融合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PP6細(xì)胞在高匯合度或低濃度血清的條件下培養(yǎng)時(shí)會很快融合成細(xì)胞鏈，而低匯合度或高血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞則不會出現(xiàn)這種情況。 共培養(yǎng)誘導(dǎo)組及直接誘導(dǎo)組在處理2天后，利用免疫細(xì)胞化學(xué)以及WesternBlotting等檢測均見平滑肌細(xì)胞特異型抗原α-SMA的表達(dá)。 研究結(jié)論：利用Preplate技