誘導(dǎo)人眼輪匝肌來(lái)源肌源干細(xì)胞分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞的研究.pdf

1、【研究背景】周?chē)窠?jīng)缺損后移植修復(fù)常以犧牲供區(qū)神經(jīng)為代價(jià)，以雪旺細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程神經(jīng)研究為周?chē)窠?jīng)損傷的修復(fù)帶來(lái)新選擇，卻同樣不可避免損傷另一條神經(jīng)。避開(kāi)胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)障礙，誘導(dǎo)成體干細(xì)胞分化為類(lèi)雪旺細(xì)胞(Schwann cell-like cell lineages，SCs-like)進(jìn)行組織工程神經(jīng)研究，正受到廣泛關(guān)注。
　　 肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)是一類(lèi)新近發(fā)

2、現(xiàn)的成體干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的一般特性。肌源性干細(xì)胞多系統(tǒng)分化潛能表現(xiàn)為經(jīng)誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，自我更新能力表現(xiàn)為經(jīng)過(guò)30次傳代培養(yǎng)后能保持初始的細(xì)胞表型及基因組構(gòu)成。具有移植免疫優(yōu)越性是肌源性干細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。肌源性干細(xì)胞日益被應(yīng)用到骨骼、肌肉等組織的再生醫(yī)學(xué)研究中，已有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明MDSCs能促進(jìn)肌纖維的再生、增強(qiáng)再生肌組織的功能，并能少量分化為神經(jīng)外膜組織和具有雪旺細(xì)胞（Schwan

3、n cells，SCs）表型的細(xì)胞。后者為組織工程神經(jīng)研究尋找新的類(lèi)雪旺細(xì)胞作為種子細(xì)胞帶來(lái)可能。近年人源肌源干細(xì)胞（human muscle-derived stem cells，h-MDSCs）的成功分離拉近了肌源干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用之間的距離。
　　 【目的】（1）掌握顯微鏡下小鼠肌組織分離和肌源干細(xì)胞分離過(guò)程中三重酶消化和細(xì)胞篩過(guò)濾方法，應(yīng)用改良的差速貼壁法從小鼠肌組織分離得到肌源干細(xì)胞，應(yīng)用有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細(xì)

4、胞單細(xì)胞克隆和亞克隆集落；（2）從重瞼成形術(shù)廢棄的組織中尋找可供利用的健康肌組織，并分析其作為科學(xué)研究用途的合理性；（3）借鑒小鼠肌源干細(xì)胞分離方法，建立從人眼輪匝肌組織分離人源肌源干細(xì)胞的方法，為人成體干細(xì)胞的研究提供新的組織分離來(lái)源，并分析其獲取方法從“微創(chuàng)”到“無(wú)創(chuàng)”的進(jìn)步；（4）從大鼠坐骨神經(jīng)獲取雪旺細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，制備雪旺細(xì)胞條件培養(yǎng)液；（5）將人源肌源干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞條件培液共培養(yǎng)，誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分

5、化，為組織工程神經(jīng)研究尋找可能的種子細(xì)胞替代物。
　　 【方法】（1）顯微鏡下依次剝離骨、軟骨和神經(jīng)血管組織，獲得較為單一的小鼠肌組織；經(jīng)過(guò)膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化，繼以100目、200目和400目細(xì)胞篩過(guò)濾，得到富含肌源干細(xì)胞的細(xì)胞懸液；通過(guò)改良差速貼壁法的首次貼壁時(shí)間為1小時(shí)，分離和培養(yǎng)小鼠肌源干細(xì)胞，相差顯微鏡下觀察歷次貼壁細(xì)胞和肌源干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；通過(guò)有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細(xì)胞單細(xì)胞克隆和亞克隆集

6、落，描繪細(xì)胞克隆生長(zhǎng)曲線；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記肌源干細(xì)胞表面Desmin和Sca-1，鑒定其細(xì)胞來(lái)源和表面干細(xì)胞特異標(biāo)記物；（2）2010年7月至2010年11月間，選擇三名行重瞼成形術(shù)的女性患者作為志愿者（年齡19-24周歲）。志愿者在第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院整形外科接受切開(kāi)法重瞼成形術(shù)后，收集志愿者提供的眼輪匝肌，進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)與獲取人體健康組織的常見(jiàn)方法比較，分析重瞼成形術(shù)中獲取眼輪匝肌作為研究對(duì)象的合理性；（

7、3）借鑒小鼠肌源干細(xì)胞分離方法，鏡下依次去除附著于肌組織的筋膜組織和神經(jīng)血管組織，獲得較為單一的眼輪匝肌組織；經(jīng)膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化，繼以100目、200目和400目細(xì)胞篩過(guò)濾，得到富含人源肌源干細(xì)胞的細(xì)胞懸液；通過(guò)差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，分離和培養(yǎng)人源肌源干細(xì)胞，相差顯微鏡下觀察人源肌源干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法鑒定人源肌源干細(xì)胞表面Desmin和Sca-1，鑒定其細(xì)胞來(lái)源和表面干細(xì)胞特異標(biāo)記物

8、；通過(guò)與人成體干細(xì)胞常見(jiàn)分離方法的比較，分析該方法“無(wú)創(chuàng)”的優(yōu)越性；(4)獲取新生大鼠坐骨神經(jīng)，顯微鏡下去除神經(jīng)外膜，胰蛋白酶消化后，進(jìn)行雪旺細(xì)胞的的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法鑒定雪旺細(xì)胞并分析細(xì)胞純度；通過(guò)半量換液，收集雪旺細(xì)胞條件培液；（5）通過(guò)與雪旺細(xì)胞條件培液共培養(yǎng)，誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分化，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面的雪旺細(xì)胞特異標(biāo)記物S100，GFAP和p7

9、5。
　　 【結(jié)果】（1）通過(guò)應(yīng)用改良的差速貼壁法和有限稀釋技術(shù)，從小鼠肌組織成功分離培養(yǎng)出肌源干細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征，呈現(xiàn)集落樣生長(zhǎng)，增殖速度快，未發(fā)生分化。免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞均呈現(xiàn)Desmin陽(yáng)性染色，Sca-1陽(yáng)性染色，Sca-1陽(yáng)性率為92.3±4.1％；（2）收集三名接受重瞼成形術(shù)的患者志愿提供的雙側(cè)上瞼眼輪匝肌共6 條，雙側(cè)眼輪匝肌濕重合計(jì)156-241mg之間，達(dá)到分離細(xì)胞所需

10、的組織量；（3）從眼輪匝肌中分離和培養(yǎng)人源肌源干細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征，增殖速度快，未發(fā)生分化。免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞均呈現(xiàn)Desmin 陽(yáng)性染色，Sca-1陽(yáng)性染色，Sca-1陽(yáng)性率為81.8±2.4％；（4）成功分離大鼠坐骨神經(jīng)來(lái)源的雪旺細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)，免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記雪旺細(xì)胞表面S100蛋白，顯示S100染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率為97.4±0.7％；通過(guò)半量換液，制備雪旺細(xì)胞條件培液；（

11、5）成功誘導(dǎo)人源肌源干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞方向分化，免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記分化后類(lèi)雪旺細(xì)胞表面特異標(biāo)記物S100，GFAP和p75，染色結(jié)果顯示陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為65.1±3.4％，23.3±1.7％和30.3±5.2％。
　　 【結(jié)論】（1）應(yīng)用改良的差速貼壁法，可從小鼠肌組織中分離得到肌源干細(xì)胞；
　　 （2）借鑒小鼠肌源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，可從人眼輪匝肌分離得到人源肌源干細(xì)胞，增加了肌源干細(xì)胞的分離來(lái)源，為人源成體干細(xì)