Myostatin對(duì)豬肌衛(wèi)星細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞成脂分化的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量影響著豬肉的感官品質(zhì)性狀（多汁性、嫩度和風(fēng)味等），同時(shí)它也與人類的胰島素耐受性等疾病密切相關(guān)。存在于肌肉中的兩種干細(xì)胞群體（脂肪來(lái)源干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞）均具有分化為脂肪細(xì)胞的特性，但是肌內(nèi)脂肪細(xì)胞主要來(lái)源于哪種細(xì)胞并未得到證實(shí)。Myostatin(MSTN)是由肌細(xì)胞分泌的、對(duì)肌肉生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用的分泌性蛋白，屬于TGF-β超家族。本課題組前期的研究結(jié)果表明，MSTN處理肌衛(wèi)星細(xì)胞后其脂肪分化潛能受到抑制，但是MSTN處理后

2、的脂肪來(lái)源干細(xì)胞分化潛能卻未受到抑制，由此推測(cè):肌內(nèi)脂肪細(xì)胞可能主要來(lái)源于脂肪來(lái)源干細(xì)胞。但是，MSTN如何對(duì)這兩種細(xì)胞的成脂分化發(fā)揮不同的調(diào)控作用的機(jī)制仍是未知的，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞主要來(lái)源于脂肪來(lái)源干細(xì)胞的推測(cè)也未得到證實(shí)。為了解決以上問(wèn)題，本論文主要開展兩方面研究:首先用MSTN蛋白分別處理豬肌衛(wèi)星細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞，比較肌肉生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因成肌分化因子1（MyoD）和脂肪發(fā)育關(guān)鍵基因過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)在MSTN

3、處理前后的表達(dá)情況;探討MyoD對(duì)PPARγ基因的調(diào)控作用。然后，豬肌衛(wèi)星細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞經(jīng)MSTN處理48 h，利用高通量表達(dá)譜測(cè)序的方法篩選MSTN處理前后差異表達(dá)的基因，并對(duì)差異表達(dá)基因影響細(xì)胞成脂分化的作用進(jìn)行研究。主要研究成果如下:
　　1.MSTN對(duì)PPARγ和MyoD基因表達(dá)量的影響
　　首先用酶消化法分離豬的脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)和肌衛(wèi)星細(xì)胞(MSCs)，然后分別通過(guò)免疫組化檢測(cè)desmin和CD4

4、4的表達(dá)情況及油紅O染色鑒定細(xì)胞的成脂分化能力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果表示:成功分離了豬脂肪來(lái)源干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞。
　　脂肪來(lái)源干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)濃度為100 ng/mL MSTN分別處理0h、24 h、48 h，然后檢測(cè)PPARγ和MyoD在mRNA水平、蛋白水平及DNA甲基化水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:在脂肪來(lái)源干細(xì)胞中，MSTN處理24 h組與0h組相比，PPARγ和MyoD的表達(dá)量沒(méi)有顯著性變化，但是MyoD的表達(dá)量有上升

5、的趨勢(shì);MSTN處理48 h組與0h組相比，PPARγ的mRNA水平顯著性上升了2.76倍，MyoD的mRNA水平顯著性上升了8.33倍;從0h至48 h，PPARγ和MyoD的蛋白表達(dá)量持續(xù)增加，而啟動(dòng)子甲基化水平降低。在肌衛(wèi)星細(xì)胞中，MSTN處理0h至48 h的過(guò)程中，PPARγ和MyoD的mRNA水平持續(xù)下降;與0h相比，24 h和48 h時(shí)的PPARγ和MyoD的蛋白表達(dá)量減少，啟動(dòng)子甲基化水平上升。
　　總之，在脂肪來(lái)源

6、干細(xì)胞中MSTN促進(jìn)了PPARγ和MyoD的表達(dá)，并且與PPARγ相比，MyoD的表達(dá)量在mRNA水平上上升的時(shí)間較早(24h)且上升的程度較高(8.33＞2.76)。而在肌衛(wèi)星細(xì)胞中MSTN抑制了PPARγ和MyoD的表達(dá)。表明，在兩種細(xì)胞中MSTN對(duì)PPARγ和MyoD表達(dá)量的影響不同，進(jìn)而影響了脂肪來(lái)源干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞的成脂分化。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子MyoD對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　結(jié)果顯示:在脂肪來(lái)源干細(xì)胞中超

7、表達(dá)MyoD基因顯著性上調(diào)了PPARγ的表達(dá)，并且超表達(dá)組的脂滴沉積量及脂肪標(biāo)記基因(aP2和C/EBPα)的mRNA表達(dá)量都高于對(duì)照組，這表明超表達(dá)MyoD增強(qiáng)了細(xì)胞的成脂分化能力。而在肌衛(wèi)星細(xì)胞中干涉MyoD基因顯著性降低了PPARγ的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞的成脂分化能力受到抑制。
　　構(gòu)建5個(gè)PPARγ啟動(dòng)子缺失片段，雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示pGL3-PPARγP3的活性最高。轉(zhuǎn)染MyoD超表達(dá)載體(pcDNA-MyoD)顯著提高

8、了缺失片段的熒光值。以野生型pGL3-PPARγP3質(zhì)粒為模板，將預(yù)測(cè)的MyoD結(jié)合位點(diǎn)和E-box位點(diǎn)突變后與pcDNA-MyoD共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒相比其熒光活性顯著性降低。EMSA和ChIP-PCR分別從體外、體內(nèi)證明了MyoD可以直接結(jié)合到PPARγ啟動(dòng)子區(qū)。
　　3.MSTN處理豬ADSCs和MSCs后差異表達(dá)基因的篩選及功能分析
　　豬脂肪來(lái)源干細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞的MSTN處理組及各自的對(duì)照組于48

9、h時(shí)利用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)共構(gòu)建12個(gè)測(cè)序文庫(kù)用于高通量表達(dá)譜測(cè)序。其中規(guī)定AM為脂肪來(lái)源干細(xì)胞MSTN處理組;AC為脂肪來(lái)源干細(xì)胞對(duì)照組;MM為肌衛(wèi)星細(xì)胞MSTN處理組;MC為肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)照組。測(cè)序結(jié)果顯示:AC與MC相比有257個(gè)差異表達(dá)基因（116個(gè)上調(diào)表達(dá)，141個(gè)下調(diào)表達(dá)）;AM與AC相比有139個(gè)差異表達(dá)基因（37個(gè)上調(diào)表達(dá)，102個(gè)下調(diào)表達(dá)）;AM與MM相比有741個(gè)差異表達(dá)基因(649個(gè)

10、上調(diào)表達(dá)，92個(gè)下調(diào)表達(dá));MM與MC相比有1640個(gè)差異表達(dá)基因（60個(gè)上調(diào)表達(dá)，1580個(gè)下調(diào)表達(dá)）。
　　將AM/AC組差異表達(dá)基因及MM/MC組差異表達(dá)基因經(jīng)GO功能分析和KEGG通路分析，篩選與脂肪發(fā)育相關(guān)且在兩個(gè)對(duì)比組中有不同的表達(dá)模式的差異基因，本研究中選擇了兩個(gè)基因（WISP2和KLF6）做后續(xù)的研究。油紅O結(jié)果顯示:超表達(dá)WISP2抑制了脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成脂分化，而干涉WISP2則促進(jìn)了脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成脂分化。

11、超表達(dá)KLF6促進(jìn)了脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成脂分化，而干涉KLF6則抑制了脂肪來(lái)源干細(xì)胞的成脂分化。
　　結(jié)論:①在脂肪來(lái)源干細(xì)胞中，MSTN促進(jìn)MyoD的表達(dá)，然后MyoD作為轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到PPARγ的啟動(dòng)子區(qū)域并且對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性起到促進(jìn)作用，PPARγ的表達(dá)進(jìn)而觸發(fā)了細(xì)胞的成脂分化;而在肌衛(wèi)星細(xì)胞中，MSTN抑制MyoD的表達(dá)，MyoD對(duì)PPARγ的促進(jìn)作用中斷，細(xì)胞的成脂分化也受到影響。②PPARγ和MyoD的表達(dá)受到啟動(dòng)子甲基