人吸脂來源的干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的研究.pdf

1、脂肪干細(xì)胞不僅具有跟骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的多向分化潛能，而且具有取材方法簡便、來源廣泛、患者創(chuàng)傷小等優(yōu)勢，這都使其成為近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。干細(xì)胞應(yīng)用的一個(gè)重要方向就是脂肪組織工程，由于脂肪干細(xì)胞具有上述優(yōu)點(diǎn)，這無疑令脂肪干細(xì)胞成為構(gòu)建工程脂肪組織的種子細(xì)胞的最佳選擇，如何實(shí)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞的成脂分化，是構(gòu)建工程脂肪組織重要的研究課題。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趯νㄟ^共培養(yǎng)人體吸脂來源的脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞，促使脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂分化

2、，并通過各種生物學(xué)檢測手段，觀察干細(xì)胞經(jīng)過共培養(yǎng)后的成脂分化效果。 具體方法是：首先采用膠原酶消化的方法，從吸脂手術(shù)來源的人體脂肪組織中，分別分離得到人體脂肪干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。對分離得到的脂肪細(xì)胞在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、特異性的油紅O染色并拍照觀察、臺盼藍(lán)死活染色并拍照觀察、脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)觀察等鑒定檢測的實(shí)驗(yàn)；對于分離得到的脂肪干細(xì)胞在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、cck-8法檢測動力學(xué)生長曲線、對脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后進(jìn)行特異性

3、的油紅O和臺盼藍(lán)復(fù)合染色實(shí)驗(yàn)、Hoechst熒光染色、流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面抗原的檢測。 通過以上的實(shí)驗(yàn)觀察和檢測，證明本實(shí)驗(yàn)收獲的細(xì)胞確實(shí)為形態(tài)完整，功能健全的脂肪干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。 接下來把分離得到的人體吸脂來源的脂肪干細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分別采用1:5，1:1，2:1和5:1四個(gè)比例，在Transwell中進(jìn)行共培養(yǎng)。采用脂質(zhì)染料油紅O和細(xì)胞核染料臺盼藍(lán)對共培養(yǎng)后的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)算成脂

4、分化率。同時(shí)，通過混合成脂誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞，并以此為成脂分化的陽性對照組，以不加任何誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞為成脂分化的陰性對照組。結(jié)合共培養(yǎng)對照組，分析考察了本實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)條件下，各個(gè)不同細(xì)胞比例培養(yǎng)組之間，成脂誘導(dǎo)分化效果的差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：用脂肪干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞的共培養(yǎng)這種方式，共培養(yǎng)8天內(nèi)尚不能促使脂肪干細(xì)胞成脂分化。對于未能實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞成脂分化的原因可能有如下兩點(diǎn)：一是共培養(yǎng)時(shí)間過短所致。第二點(diǎn)原因則可

5、能是單純這種干細(xì)胞與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)方法并不能實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞向成脂方向的分化。 鑒于以上第一點(diǎn)原因，本人將共培養(yǎng)時(shí)間延長至20天，并采用流式細(xì)胞儀分析共培養(yǎng)后脂肪干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記的表達(dá)。同時(shí)，對共培養(yǎng)后的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行了Hoechst和PI的死活熒光檢測。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過20天共培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞仍未發(fā)生明顯的成脂分化現(xiàn)象，但其表面抗原CD105的表達(dá)發(fā)生明顯降低，這可能意味著脂肪干細(xì)胞經(jīng)過共培養(yǎng)后發(fā)生了一定程度的分化。