脂肪組織來源干細(xì)胞單克隆培養(yǎng)技術(shù)及其表面抗原的研究.pdf

1、背景： 組織工程技術(shù)以少量的種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物材料結(jié)合，修復(fù)較大的組織或器官缺損，重建缺損部位的生理功能，為臨床上解決組織缺損等難題提供了一條新途徑，近來受到廣泛關(guān)注。 如何獲得來源廣泛、充足的種子細(xì)胞是此項技術(shù)的關(guān)鍵。成體干細(xì)胞來源廣泛、功能良好，是種子細(xì)胞的研究重點。成體干細(xì)胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉等各類組織，其中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，發(fā)現(xiàn)早、取材方便、創(chuàng)傷小，被研究的最多。隨著研究的普及和深

2、入，脂肪組織來源干細(xì)胞(ADSCs)逐漸被人們認(rèn)識，與BMSCs相比，ADSCs在體內(nèi)分布更廣，可利用的細(xì)胞量更多。ADSCs自1994年被發(fā)現(xiàn)以來己證實能向多種類型的細(xì)胞分化，并且具有取材方便、創(chuàng)傷小而細(xì)胞獲得量大、病人易于接受的優(yōu)勢，在組織工程的研究和應(yīng)用中顯示出了巨大的潛力。 目前普遍認(rèn)為，常用方法分離出的ADSCs是由多種分化潛能不同的細(xì)胞亞群以及大量的混雜細(xì)胞組成的混合群體，其中只有部分能夠形成脂肪細(xì)胞，因而必然會影響

3、其構(gòu)建脂肪組織的成功率。如何提高從脂肪組織中提取干細(xì)胞的純度和尋找確認(rèn)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記等問題一直是目前急于解決的難題之一。雖然對于ADSCs的表面抗原的研究已有諸多報道，但有關(guān)ADSCs的特異性表面標(biāo)志仍無統(tǒng)一認(rèn)識，對于特定分化潛能和標(biāo)志物表達(dá)之間是否存在關(guān)聯(lián)至今尚未見有報道。此外，有關(guān)用于純化細(xì)胞群獲得單細(xì)胞的克隆形成試驗，國外雖有利用環(huán)克隆的方法從脂肪來源細(xì)胞中分離培養(yǎng)出分化潛能不同的多種細(xì)胞克隆，但未對其進(jìn)行相關(guān)表面抗原的分析，國

4、內(nèi)也未見有用此種方法進(jìn)行干細(xì)胞研究的報道。本實驗擬通過單克隆培養(yǎng)的方法，分離純化出由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆，達(dá)到純化脂肪組織來源干細(xì)胞的目的，并檢測其表面抗原的表達(dá)，同時針對不同克隆鑒定其成脂分化的潛力，并檢測了成脂誘導(dǎo)劑對ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的影響，尋找ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。為ADSCs在脂肪組織工程中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 目的： 1.提取人體皮下脂肪組織來源干細(xì)胞(ADSCs)進(jìn)行

5、單克隆培養(yǎng)和擴(kuò)增，以獲得單克隆ADSCs，并鑒定不同克隆細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)表面抗原表達(dá)。 2.針對不同克隆ADSCs通過對其生長動力學(xué)、形態(tài)學(xué)、成脂分化能力等方面的特征進(jìn)行鑒定比較，探索ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，尋找代表定向成脂分化亞群的細(xì)胞標(biāo)志，從而提高構(gòu)建脂肪組織的成功率。 3.對比成脂誘導(dǎo)前后ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的變化，研究成脂誘導(dǎo)劑對ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達(dá)的影響，為ADSCs

6、在脂肪組織工程中的應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： 臨床手術(shù)切取脂肪組織，經(jīng)膠原酶消化法原代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)并傳至第2代后，有限稀釋法進(jìn)行克隆形成實驗。針對獲得的單克隆ADSCs，觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點，并用流式細(xì)胞儀檢測不同克隆CD29、CD34、CD44、CD54、CD106、ABCG2的表達(dá)。各克隆分別進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，油紅O染色鑒定分化潛能。第3代的ADSCs細(xì)胞分別于成脂誘導(dǎo)7天前、后檢測其CD34、CD54

7、、CD106的表達(dá)。第4代ADSCs進(jìn)行成脂、成骨定向誘導(dǎo)分化，油紅“O”染色、茜素紅染色定性。 結(jié)果： 從皮下切取的脂肪組織中能培養(yǎng)出大量的ADSCs，通過克隆形成實驗共獲得10個單克隆細(xì)胞群，不同克隆細(xì)胞在形態(tài)及增殖活力上存在差異，細(xì)胞群擴(kuò)增到第9～11代后可獲得細(xì)胞數(shù)2×106，進(jìn)行后續(xù)研究及凍存。干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志檢測顯示：各個克隆群體均高表達(dá)CD29(92.9±7.4％)、CD44(94.6±6.8％)；低表達(dá)AB

8、CG2(2.5±1.4％)：但CD34、CD54和ICD106的表達(dá)在不同群體間有明顯差異。不同克隆的成脂分化潛力明顯不同，油紅“O”染色可見部分含紅染顆粒的陽性細(xì)胞高達(dá)60％，部分為陰性結(jié)果，說明ADSCs中存在成脂分化能力不同的細(xì)胞群。第3代ADSCs在成脂誘導(dǎo)7天后CD34、CD54和ICD106的表達(dá)較誘導(dǎo)之前無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。ADSCs成脂誘導(dǎo)分化兩周，可見細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴，油紅“O”染色可見胞漿內(nèi)有大量紅染顆粒；成骨誘導(dǎo)分化

9、兩周可肉眼看到白色礦化的顆粒狀鈣鹽沉積，經(jīng)茜素紅染色鑒定可發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞及鈣鹽沉積被紅染。 結(jié)論： 本實驗結(jié)果證明：皮下脂肪組織經(jīng)過酶消化原代培養(yǎng)可提取有多向分化能力的干細(xì)胞，通過克隆形成試驗培養(yǎng)的方法可以純化ADSCs，獲得高純度具有間充質(zhì)細(xì)胞特性的細(xì)胞群，體外多次傳代、長期培養(yǎng)并不改變細(xì)胞形態(tài)和增殖活性。不同的單克隆細(xì)胞群之間表面標(biāo)志的表達(dá)和成脂分化能力存在共性和差異。差異較顯著的CD34及CD54可能作為ADSCs中