脂肪組織來源干細胞單克隆培養(yǎng)技術(shù)及其表面抗原的研究.pdf

1、背景： 組織工程技術(shù)以少量的種子細胞經(jīng)體外擴增后與生物材料結(jié)合，修復較大的組織或器官缺損，重建缺損部位的生理功能，為臨床上解決組織缺損等難題提供了一條新途徑，近來受到廣泛關(guān)注。 如何獲得來源廣泛、充足的種子細胞是此項技術(shù)的關(guān)鍵。成體干細胞來源廣泛、功能良好，是種子細胞的研究重點。成體干細胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉等各類組織，其中骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)，發(fā)現(xiàn)早、取材方便、創(chuàng)傷小，被研究的最多。隨著研究的普及和深

2、入，脂肪組織來源干細胞(ADSCs)逐漸被人們認識，與BMSCs相比，ADSCs在體內(nèi)分布更廣，可利用的細胞量更多。ADSCs自1994年被發(fā)現(xiàn)以來己證實能向多種類型的細胞分化，并且具有取材方便、創(chuàng)傷小而細胞獲得量大、病人易于接受的優(yōu)勢，在組織工程的研究和應用中顯示出了巨大的潛力。 目前普遍認為，常用方法分離出的ADSCs是由多種分化潛能不同的細胞亞群以及大量的混雜細胞組成的混合群體，其中只有部分能夠形成脂肪細胞，因而必然會影響

3、其構(gòu)建脂肪組織的成功率。如何提高從脂肪組織中提取干細胞的純度和尋找確認干細胞的相關(guān)標記等問題一直是目前急于解決的難題之一。雖然對于ADSCs的表面抗原的研究已有諸多報道，但有關(guān)ADSCs的特異性表面標志仍無統(tǒng)一認識，對于特定分化潛能和標志物表達之間是否存在關(guān)聯(lián)至今尚未見有報道。此外，有關(guān)用于純化細胞群獲得單細胞的克隆形成試驗，國外雖有利用環(huán)克隆的方法從脂肪來源細胞中分離培養(yǎng)出分化潛能不同的多種細胞克隆，但未對其進行相關(guān)表面抗原的分析，國

4、內(nèi)也未見有用此種方法進行干細胞研究的報道。本實驗擬通過單克隆培養(yǎng)的方法，分離純化出由單一細胞形成的細胞克隆，達到純化脂肪組織來源干細胞的目的，并檢測其表面抗原的表達，同時針對不同克隆鑒定其成脂分化的潛力，并檢測了成脂誘導劑對ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達的影響，尋找ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達之間的關(guān)聯(lián)。為ADSCs在脂肪組織工程中的應用提供實驗依據(jù)。 目的： 1.提取人體皮下脂肪組織來源干細胞(ADSCs)進行

5、單克隆培養(yǎng)和擴增，以獲得單克隆ADSCs，并鑒定不同克隆細胞的干細胞相關(guān)表面抗原表達。 2.針對不同克隆ADSCs通過對其生長動力學、形態(tài)學、成脂分化能力等方面的特征進行鑒定比較，探索ADSCs成脂分化潛能和表面抗原表達之間的關(guān)聯(lián)，尋找代表定向成脂分化亞群的細胞標志，從而提高構(gòu)建脂肪組織的成功率。 3.對比成脂誘導前后ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達的變化，研究成脂誘導劑對ADSCs部分相關(guān)表面抗原表達的影響，為ADSCs

6、在脂肪組織工程中的應用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： 臨床手術(shù)切取脂肪組織，經(jīng)膠原酶消化法原代培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)并傳至第2代后，有限稀釋法進行克隆形成實驗。針對獲得的單克隆ADSCs，觀察其在體外培養(yǎng)的形態(tài)學和生物學特點，并用流式細胞儀檢測不同克隆CD29、CD34、CD44、CD54、CD106、ABCG2的表達。各克隆分別進行成脂誘導，油紅O染色鑒定分化潛能。第3代的ADSCs細胞分別于成脂誘導7天前、后檢測其CD34、CD54

7、、CD106的表達。第4代ADSCs進行成脂、成骨定向誘導分化，油紅“O”染色、茜素紅染色定性。 結(jié)果： 從皮下切取的脂肪組織中能培養(yǎng)出大量的ADSCs，通過克隆形成實驗共獲得10個單克隆細胞群，不同克隆細胞在形態(tài)及增殖活力上存在差異，細胞群擴增到第9～11代后可獲得細胞數(shù)2×106，進行后續(xù)研究及凍存。干細胞相關(guān)標志檢測顯示：各個克隆群體均高表達CD29(92.9±7.4％)、CD44(94.6±6.8％)；低表達AB

8、CG2(2.5±1.4％)：但CD34、CD54和ICD106的表達在不同群體間有明顯差異。不同克隆的成脂分化潛力明顯不同，油紅“O”染色可見部分含紅染顆粒的陽性細胞高達60％，部分為陰性結(jié)果，說明ADSCs中存在成脂分化能力不同的細胞群。第3代ADSCs在成脂誘導7天后CD34、CD54和ICD106的表達較誘導之前無明顯統(tǒng)計學差異。ADSCs成脂誘導分化兩周，可見細胞內(nèi)有大量脂滴，油紅“O”染色可見胞漿內(nèi)有大量紅染顆粒；成骨誘導分化

9、兩周可肉眼看到白色礦化的顆粒狀鈣鹽沉積，經(jīng)茜素紅染色鑒定可發(fā)現(xiàn)成骨細胞及鈣鹽沉積被紅染。 結(jié)論： 本實驗結(jié)果證明：皮下脂肪組織經(jīng)過酶消化原代培養(yǎng)可提取有多向分化能力的干細胞，通過克隆形成試驗培養(yǎng)的方法可以純化ADSCs，獲得高純度具有間充質(zhì)細胞特性的細胞群，體外多次傳代、長期培養(yǎng)并不改變細胞形態(tài)和增殖活性。不同的單克隆細胞群之間表面標志的表達和成脂分化能力存在共性和差異。差異較顯著的CD34及CD54可能作為ADSCs中