人脂肪來源干細胞裸鼠皮下移植的實驗性研究.pdf

1、目的： 1．分離和培養(yǎng)人脂肪來源干細胞(hADSCs)，對hADSCs的干細胞特性進行鑒定。 2．將表達pEGFP-N3的hADSCs進行裸鼠皮下注射移植，觀察細胞的存活和轉歸。 材料和方法： 人脂肪組織取材，酶消化法分離培養(yǎng)hADSCs。觀察細胞形態(tài)。以成脂和成骨誘導液連續(xù)培養(yǎng)hADSCs 3周后，分別進行油紅染色和鈣鹽染色，觀察細胞多向分化能力。分別于原代和第3代用流式細胞儀對細胞進行細胞表面分化抗原

2、CD45、CD34、CD133檢測，觀察細胞不同階段的表型特征。hADSCs體外培養(yǎng)后，以脂質(zhì)體法轉染pEGFP-N3質(zhì)粒，經(jīng)G418篩選，獲得高陽性率的細胞。將篩選后的細胞以注射方式植入裸鼠皮下組織中。分別于8周和12周取材，利用活體化學發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)進行活體熒光觀察，組織切片觀察，確定hADSCs植入裸鼠皮下后的存活情況與轉歸。 結果： 1．利用膠原酶消化法，膠原酶/脂肪比3：1、膠原酶濃度1mg/ml、消化時間

3、1h，可以獲得大量hADSCs。體外培養(yǎng)的人ADSC細胞為成纖維細胞樣。 2．hADSCs在成脂和成骨誘導液作用下，可以分別向脂肪細胞和成骨細胞分化，表現(xiàn)為油紅染色和鈣鹽染色陽性。 3．在新鮮分離的細胞中有大量CD45+CD34+細胞(37.62％)和CD45·CD34+細胞(24.22％)；原代細胞中，CD34+CD45-細胞占大多數(shù)(58.76％)，未見CD45+細胞和CD133+細胞。培養(yǎng)3代后，CD34+CD45

4、-細胞比例降低(30.47％)，CD45+細胞僅見少量，未見CD133+細胞。 4.pEGFP-N3質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物轉化脂肪來源干細胞24h后，大量細胞表達綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白陽性細胞率達(13.0±3.5)％。以適宜濃度G418篩選后，綠色熒光蛋白陽性細胞率達(65.0±5.4)％。 5．以注射方式將pEGFP-N3轉染后的hADSCs植入裸鼠皮下組織中，8w和12w后，大體標本可見植入?yún)^(qū)周圍分布熒光陽性區(qū)；熒

5、光鏡下可見皮下組織中分布熒光陽性細胞，對應光鏡下皮下組織中未見熒光陽性結構。 結論： 1．脂肪組織中可以分離獲得大量可貼壁生長的細胞，其具有多向分化能力，并具有與干細胞相同的表型特點，即CD34+CD45-CD133-。 2．以脂質(zhì)體法可以將pEGFP-N3質(zhì)粒轉染入hADSCs，G418篩選后陽性率明顯提高。 3．hADSCs裸鼠皮下移植后可以向脂肪細胞分化，hADSCs可作為脂肪組織工程的種子細胞。