低強度高頻率振動對成骨細胞生物學特性的影響及機制.pdf

1、研究背景：
　　 骨質(zhì)疏松癥是中老年人群的常見病,以全身骨量減少,骨組織的微細結(jié)構(gòu)破壞,骨強度降低和骨折危險性增高為特征。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是骨質(zhì)疏松性骨折,其中以髖部骨折危害最大,不僅髖部活動功能損傷明顯,而且死亡率高。隨著老齡化社會的到來,骨質(zhì)疏松癥防治的臨床與基礎研究已成為醫(yī)學界研究的熱點。運動是預防和治療骨質(zhì)疏松的重要因素。近年來,具有無創(chuàng)、副反應小、依從性好等特點的物理因子療法防治骨質(zhì)疏松癥逐漸受到重視。全身振動運動

2、是振動療法中的一種,是指借助于振動儀器,使振動刺激通過下肢或軀干作用于全身,使機體整體振動,以達到防治疾病目的的方法。對去卵巢模型動物、低骨量人群及絕經(jīng)后女性的研究顯示,低于引起組織損傷的機械振動信號-低強度高頻率振動(Low-magnitude,high-frequency vibrallion,LMHFV),具有較好的增加骨形成和抑制骨吸收作用。作為一種治療骨質(zhì)疏松癥的新方法,LMHFV具有無創(chuàng)、副反應小、高依從性的特點,能降低骨質(zhì)

3、疏松性骨折的發(fā)生率,在骨質(zhì)疏松癥的預防和治療領域越來越受到重視。但是,LMHFV增加骨形成、抑制骨吸收的具體機制仍不清楚。
　　 研究證明,振動應力可以影響成骨細胞的生物學特性,但振動應力影響成骨細胞生物學特性的具體機制尚不清楚。因此,研究振動應力影響成骨細胞生物學特性的分子機制,以其作為切入點進一步闡明LMHFV預防和治療骨質(zhì)疏松的機制,將為全身振動運動預防和治療骨質(zhì)疏松提供科學依據(jù)。
　　 本研究通過自行研制的細胞振

4、動儀,對體外培養(yǎng)的成骨前體MC3T3-E1細胞施加低強度(0.3g)、不同高頻率(0、30、45、60、90Hz)振動(LMHFV),結(jié)合分子生物學檢測技術,觀察LMHFV對成骨前體MC3T3-E1細胞生物學特性的影響及其機制的初步研究。研究內(nèi)容如下:
　　 目的：
　　 1.研究低強度高頻率振動(LMHFV)對成骨細胞生物學特性的影響。
　　 2.研究環(huán)氧合酶-2(COX-2)在LMHFV影響成骨細胞生物學特性

5、中的作用。
　　 3.研究LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 方法：
　　 Ⅰ.低強度、高頻率振動(LMHFV)影響成骨細胞生物學特性的作用
　　 1.LMHFV影響成骨細胞OPG/RANKL比率的作用
　　 (1)LMHFV對成骨細胞OPG/RANKL比率的影響
　　 對MC3T3-E1細胞施加頻率0、30、45、60、90Hz,強度0.3g,時間30min的

6、振動,分別于振動后0、0.5、1.5、3、6h收集細胞培養(yǎng)上清液。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測LMHFV加載后不同時間MC3T3-E1細胞分泌可溶性OPG、RANKL的情況。通過計算OPG/RANKL比率,將增加OPG/RANKL比率最高的振動頻率做為本實驗繼續(xù)研究的頻率。
　　 (2)LMHFV加載成骨細胞條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM)對破骨細胞分化成熟的影響
　　 LMHFV(30Hz

7、)加載MC3T3-E1細胞后含OPG/RANKL比率最高的條件培養(yǎng)基(Conditioned mediam,CM30Hz)及LMHFV(0Hz)加載后的條件培養(yǎng)基(Conditioned mediam,CM0Hz),分別與含40ng/ml sRANKL、20ng/ml M-CSF的1640培養(yǎng)基按體積比1:1混合形成混合培養(yǎng)基。將破骨細胞前體RAW264.7細胞隨機分為Control組(CM0Hz)、實驗組(CM30Hz),混合培養(yǎng)基分

8、別誘導破骨細胞前體RAW264.7細胞分化5、7天。①實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time quantitative PCR,qPCR)分別檢測第5、7天各組抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)mRNA的表達水平:②TRAP檢測試劑盒檢測第5、7天各組TRAP活性；③TRAP染色計算第7天各組多核破骨細胞形成數(shù)目。
　　 2.LMHFV影響成骨細胞分化的作用
　　 (1)LMHFV對成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣

9、素(OCN)mRNA表達的影響:
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min/day),分別加載4、8天后,收集細胞,提取細胞總RNA。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real—time quantitative PCR,qPCR)檢測ALP mRNA、OCN mRNA表達,以GAPDH為內(nèi)對照,分析A

10、LP mRNA、OCN mRNA相對表達的變化。
　　 (2)LMHFV對成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(OCN)表達的影響:
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min/day),分別加載4、8天后,收集細胞,提取細胞總蛋白,ALP檢測試劑盒檢測ALP活性；OCN ELISA試劑

11、盒檢測OCN表達；ALP活性、OCN表達均以細胞總蛋白量標準化,分析ALP活性、OCN表達相對改變的變化。
　　 (3)LMHFV對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響:
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min/day),培養(yǎng)14天后,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 Ⅱ.環(huán)氧合酶(

12、COX-2)在LMHFV影響成骨細胞生物學特性中的作用
　　 1.LMHFV對成骨細胞COX-2 mRNA及蛋白表達的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min)。分別于LMHFV干預結(jié)束后0、0.5、1.5、3、6h:①提取細胞總RNA,qPCR法檢測COX-2 mRNA表達,以GA

13、PDH為內(nèi)對照,分析COX-2 mRNA相對表達的變化；②提取細胞總蛋白,Western blot檢測COX-2蛋白表達,以β-actin為內(nèi)對照,分析COX-2蛋白相對表達的變化。
　　 2.LMHFV對成骨細胞表達PGE2活性的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min)。分別于L

14、MHFV加載結(jié)束后0、0.5、1.5、3、6h收集細胞培養(yǎng)上清、提取細胞總蛋白；在COX-2特異性抑制劑NS-398抑制實驗中,MC3T3-E1細胞先與10μM NS-398孵育1h,再施加LMHFV刺激,在LMHFV干預結(jié)束后0.5h分別收集細胞培養(yǎng)上清、提取細胞總蛋白；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中PGE2活性,并以細胞總蛋白量標準化,分析PGE2活性相對表達的變化。
　　 3.COX-2特異性抑制劑NS-398對LMHF

15、V增加成骨細胞OPG分泌的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control(0Hz)+VEHICLE組、Control(0Hz)+NS-398組、LMHFV(30Hz)+VEHICLE組、LMHFV(30Hz)+NS-398組。VEHICLE為溶解NS-398的等量DMSO,MC3T3-E1細胞先與10μMNS-398孵育1h,再施加LMHFV(0.3g,30Hz,30min)刺激,在LMHFV干預結(jié)束后6h分別收集細胞培

16、養(yǎng)上清、提取細胞總蛋白；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中可溶性OPG活性,并以細胞總蛋白量標準化,分析OPG分泌的變化。
　　 4.COX-2特異性抑制劑NS-398對LMHFV誘導成骨細胞分化作用的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control(0Hz)+VEHICLE組、Control(0Hz)+NS-398組、LMHFV(30Hz)+VEHICLE組、LMHFV(30Hz)+NS-398組。干預方法為:對細

17、胞施加8天的LMHFV(0.3g,30Hz,30min/day)刺激,VEHICLE為溶解NS-398的等量DMSO,細胞與10μM NS-398孵育8天,干預結(jié)束后,分別收集細胞、提取細胞總蛋白；按前述方法分別檢測ALP活性、OCN表達,并以細胞總蛋白量標準化,分析ALP活性、OCN表達相對改變的變化。
　　 Ⅲ.LMHFV誘導成骨細胞COX-2表達的信號轉(zhuǎn)導機制
　　 1.LMHFV誘導成骨細胞COX-2表達的信號轉(zhuǎn)

18、導途徑初探
　　 分別于MC3T3-E1細胞施加LMHFV(0.3g,30Hz,30min)刺激前1h加入各種信號通路抑制劑NS-398、Staurosporine、H-89、U0126、SP600125、SB203580,于LMHFV加載結(jié)束后3小時,提取細胞總蛋白。Western blot檢測COX-2蛋白表達,以β-actin為內(nèi)對照,分析COX-2蛋白相對表達的變化。
　　 2.cAMP/PKA信號通路對LMHF

19、V誘導成骨細胞COX-2表達的影響
　　 (1)LMHFV對成骨細胞PKA信號通路的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min),分別于LMHFV加載結(jié)束后0、0.5、1.5、3、6h收集細胞,提取細胞總蛋白。Western blot檢測PKA總蛋白及磷酸化蛋白含量,以總蛋白為對照,分

20、析PKA磷酸化蛋白含量相對值的變化。
　　 (2)LMHFV對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響
　　 MC3T3-E1細胞隨機分為Control組(0Hz)、LMHFV組(30Hz),Control組不予振動刺激,LMHFV組給予振動刺激(0.3g,30Hz,30min),分別于LMHFV加載結(jié)束后0、0.5、1.5、3、6h收集細胞。cAMP ELISA試劑盒檢測LMHFV對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響。
　　 (

21、3)LMHFV加載成骨細胞含PGE2條件培養(yǎng)基(Conditionedmedium,CMPGE2)對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響:
　　 LMHFV加載MC3T3-E1細胞結(jié)束后0.5h,分別收集0Hz、30Hz組含PGE2的條件培養(yǎng)基(CMPGE2),隨機將MC3T3-E1細胞分為CM0Hz組、CM30Hz組,與相應的CMPGE2分別共孵育0、0.5、1.5、3、6h后收集細胞,cAMP ELISA檢測試劑盒檢測CMPGE2對

22、成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響。
　　 (4)腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskolin,FSK)對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響:
　　 MC3T3-E1細胞與15μM FSK分別共孵育0、0.5、1.5、3、6h或分別與0、5、10、15、20μM FSK共孵育3h后,按cAMP ELISA檢測試劑盒要求收集細胞,檢測含F(xiàn)SK對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響。
　　 (5)PKA抑制劑對LMHFV、FSK、CMPGE2

23、誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的影響
　　 在MC3T3-E1細胞接受各種干預因素前加入30μM H-89孵育1h,分別于LMHFV(0.3g、30Hz、30min)加載細胞后3h、15μM FSK刺激細胞后3h、CMPGE2孵育細胞后3h,收集細胞,提取總蛋白。Western blot檢測COX-2蛋白表達情況,β-actin為內(nèi)對照,分析COX-2蛋白相對表達的變化。
　　 結(jié)果：
　　 Ⅰ.低強度高頻率振動

24、(LMHFV)影響成骨細胞生物學特性的作用
　　 1.LMHFV影響成骨細胞OPG/RANKL比率的作用
　　 (1)LMHFV對成骨細胞表達OPG/RANKL比率的影響:
　　 LMHFV加載結(jié)束后6h,與0Hz相比,30Hz LMHFV能明顯促進成骨細胞分泌OPG(P<0.001),但對RANKL的分泌無明顯影響,30Hz LMHFV提高成骨細胞OPG/RANKL比率最顯著(P<0.001)。
　　

25、(2)LMHFV加載成骨細胞條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM)對破骨細胞分化成熟的影響
　　 LMHFV加載結(jié)束后6小時,與0Hz相比,30Hz形成的CM含OPG/RANKL比率最高。①與含CM0Hz的混合培養(yǎng)基組相比,在第5天,CM30Hz組TRAP mRNA及活性均較CM0Hz組低,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069,P=0.160)；在第7天,CM30Hz組TRAP mRNA及活性均較CM0Hz組低,差

26、異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,P=0.043)；②與含CM0Hz的混合培養(yǎng)基組相比,在第7天,CM30Hz組形成的多核(≥3個核)破骨細胞數(shù)量減少,其中10核以上破骨細胞數(shù)量減少的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
　　 2.LMHFV影響成骨細胞分化的作用
　　 (1)LMHFV對成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)mRNA表達的影響:
　　 LMHFV加載MC3T3-E1細胞4天,與0Hz組相比

27、,30Hz組增加MC3T3-E1細胞ALP mRNA水平,其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006);LMHFV加載MC3T3-E1細胞8天,與0Hz組相比,30Hz組增加MC3T3-E1細胞ALP mRNA及OCN mRNA水平,其差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.003,P=0.001)。
　　 (2)LMHFV對成骨細胞ALP活性、OCN表達的影響:
　　 LMHFV加載MC3T3-E1細胞4天,與0Hz組相比,30Hz組增加

28、MC3T3-E1細胞ALP活性,其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.031)；LMHFV加載MC3T3-E1細胞8天,與0Hz組相比,30Hz組增加MC3T3-E1細胞ALP活性及OCN表達,其差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.003,P=0.001)。
　　 (3)LMHFV對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響:
　　 生長至80％-90％匯合的MC3T3-E1細胞,經(jīng)0Hz、30Hz LMHFV加載14天后,茜素紅染色結(jié)果顯示0Hz組、3

29、0Hz組LMHFV均可見橘紅色鈣化結(jié)節(jié),但30Hz組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目較0Hz組多,顏色較0Hz組深。
　　 Ⅱ.COX-2在LMHFV影響成骨細胞生物學特性中的作用
　　 1.LMHFV對成骨細胞COX-2 mRNA及蛋白表達的影響
　　 (1)與Control組相比,30Hz LMHFV加載成骨細胞后0、0.5、1.5、3、6h,振動組COX-2 mRNA表達均較Control組增加(all P<0.01),其中L

30、MHFV加載后0.5h COX-2 mRNA表達水平最高(P<0.001)；
　　 (2)與Control組相比,30Hz LMHFV加載成骨細胞后0.5、1.5、3、6h,振動組COX-2蛋白表達均較Control組增加(all P<0.01),其中LMHFV加載后3h COX-2蛋白表達水平達到高峰(P<0.01)。
　　 2.LMHFV對成骨細胞PGE2活性表達的影響
　　 與Control組相比,30Hz

31、 LMHFV加載成骨細胞后0、0.5、1.5、3、6h,振動組PGE2活性表達均較Control組增加(all P<0.05),其中LMHFV加載后0.5h PGE2活性表達水平最高(P=0.032)。LMHFV加載后0.5h,COX-2特異性抑制劑NS-398對LMHFV誘導MC3T3-E1細胞PGE2活性增加具有明顯的抑制作用(P<0.001)。
　　 3.COX-2特異性抑制劑對LMHFV增加成骨細胞OPG分泌的影響

32、>　　 COX-2特異性抑制劑NS-398對30Hz LMHFV加載成骨細胞后6h OPG的分泌具有抑制作用(P=0.012),NS-398可抑制LMHFV誘導的OPG/RANKL比率升高。
　　 4.COX-2特異性抑制劑對LMHFV誘導成骨細胞分化作用的影響
　　 對30Hz LMHFV加載成骨細胞8天,COX-2特異性抑制劑NS-398可明顯抑制LMHFV誘導的ALP活性、OCN表達增加(P=0.005,P=0.

33、001)。
　　 Ⅲ.LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的信號轉(zhuǎn)導機制
　　 1.LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的信號轉(zhuǎn)導途徑初探
　　 COX-2特異性抑制劑NS-398、PKA特異性抑制劑H-89、ERK1/2特異性抑制劑U0126、p38特異性抑制劑SB203580均可抑制LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白的表達(all P<0.05),而PKC特異性抑制劑Staurosporine和JN

34、K特異性抑制劑SP600125對LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白表達無明顯影響。
　　 2.cAMP/PKA信號通路對LMHFV誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的影響
　　 (1)LMHFV對成骨細胞PKA信號通路的影響
　　 與Control組相比,30Hz LMHFV加載成骨細胞后0、0.5、1.5、3h,LMHFV組PKA磷酸化活性均較Control組高,其差異均有統(tǒng)計學意義(allP<0.01),其中L

35、MHFV加載后1.5h PKA磷酸化水平最高(P<0.001)。
　　 (2)LMHFV對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響
　　 與Control組相比,30Hz LMHFV加載成骨細胞后0、0.5、1.5h,振動組細胞內(nèi)cAMP水平均較Control組增加(P<0.001,P=001,P=008),其中LMHFV加載后0.5h cAMP水平最高(P=008)。
　　 (3)LMHFV加載成骨細胞含PGE2條件培養(yǎng)基

36、(Conditioned medium,CMPGE2)對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響:
　　 LMHFV加載成骨細胞后0.5h形成的CM含PGE2水平最高,與Control組相比,CMPGE2孵育細胞0.5、1.5、3h后,CMPGE2組細胞內(nèi)cAMP水平均較Control組高(all P<0.05),其中在1.5h,CMPGE2組細胞內(nèi)cAMP水平最高(P<0.05)。
　　 (4)腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskoli

37、n,FSK)對成骨細胞內(nèi)cAMP水平的影響:
　　 與Control組相比,15μM FSK與成骨細胞孵育0.5、1.5、3h后,FSK組細胞內(nèi)cAMP水平較對照組明顯升高(P=0.003,P<0.001,P<0.001),其中在3h,FSK組細胞內(nèi)cAMP水平最高。
　　 (5)PKA抑制劑對LMHFV、FSK、CMPGE2誘導成骨細胞COX-2蛋白表達的影響
　　 與Control組相比,LMHFV,FSK及

38、CMPGE2均能誘導成骨細胞COX-2蛋白表達(P<0.001,P=001,P=008),PKA特異性抑制劑H-89均能抑制LMHFV,FSK及CMPGE2誘導成骨細胞COX-2蛋白的表達(P=001,P=001,P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.低強度(0.3g),高頻率(30Hz)振動(LMHFV)對成骨前體MC3T3-E1細胞生物學特性具有積極的影響:增加MC3T3-E1細胞OPG分泌,提高OPG/RAN