細(xì)胞粘合素C對(duì)成骨細(xì)胞中基質(zhì)小泡的影響及機(jī)制.pdf

1、基質(zhì)小泡（Matrix Vesicles，MVs）是一類直徑為20-200nm的膜包被的囊泡狀結(jié)構(gòu)，主要來源于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成牙質(zhì)細(xì)胞。MVs起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，攜帶各種蛋白質(zhì)及Ca2+等以出芽的方式分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，在釋放過程中不斷吸收Ca2+和PO43-形成無定形磷酸鈣，最終沉淀在膠原纖維上無定形磷酸鈣形成更堅(jiān)硬的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）,羥基磷灰石在MVs中繼續(xù)生長(zhǎng)，會(huì)刺破MVs的膜，定位于膠原上，從而啟動(dòng)

2、細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MVs中存在2,000多種蛋白以及多種脂類，這些組分是MVs發(fā)揮功能的關(guān)鍵成分，其中多種蛋白已經(jīng)證明在礦化過程中起作用，但是存在于MVs中的蛋白質(zhì)是否起作用，是否能夠通過調(diào)控MVs的活性和功能來參與礦化，這些都不清楚。另外，MVs在異位骨化等病理性的礦化中也起著重要的作用，如MVs的功能增強(qiáng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理機(jī)制。盡管MVs在礦化過程中起重要作用，但是目前對(duì)MVs功能的調(diào)控機(jī)制知之甚少。
　

3、　細(xì)胞粘合素C（Tenascin C，TNC）是Tenascin家族成員，是一種具有獨(dú)特的六臂體結(jié)構(gòu)的寡聚糖蛋白，由六個(gè)相同的亞基在NH2端通過二硫鍵相連。在成人中，主要由間充質(zhì)細(xì)胞分泌，少量的上皮細(xì)胞也會(huì)分泌。實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)TNC隨著礦化的進(jìn)行表達(dá)量逐漸增加，并發(fā)現(xiàn)TNC是MVs的一種成分。已有研究證明，TNC在礦化的后期起作用，在前期作用不明顯。但是，TNC影響礦化是通過調(diào)控MVs的活性和功能還是只局限于細(xì)胞水平，目前還不清

4、楚。
　　目的：本研究旨在探究TNC是否通過調(diào)控MVs的活性調(diào)控成骨細(xì)胞礦化的過程，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：（1）采用含有抗壞血酸和β-磷酸甘油的礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞成骨分化以及礦化，建立Saos-2細(xì)胞礦化模型。（2）將Saos-2細(xì)胞分為正常對(duì)照組和礦化誘導(dǎo)組，在正常對(duì)照組細(xì)胞中加入完全培養(yǎng)液，在礦化誘導(dǎo)組細(xì)胞中加入含有50μg/mL抗壞血酸和10mMβ-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，在誘導(dǎo)3、6、9天后進(jìn)行礦

5、化結(jié)節(jié)定性和定量檢測(cè)，以Western檢測(cè)TNC的表達(dá)量變化。（3）將Saos-2細(xì)胞分為陰性對(duì)照組和RNAi組（2組），陰性對(duì)照組在培養(yǎng)液中加入50μg/mL抗壞血酸和10mMβ-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)液及陰性對(duì)照的siRNA片段。三組細(xì)胞在培養(yǎng)第3天分別進(jìn)行礦化相關(guān)基因ALP, Runx2和 COL1A1的表達(dá)量檢測(cè)，在培養(yǎng)6天進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定性、定量檢測(cè)及Western驗(yàn)證相關(guān)蛋白表達(dá)量變化。（4）用ExoQuickTM試劑方法提取三組

6、Saos-2細(xì)胞的細(xì)胞外分泌物。然后，用Western Blot的方法檢測(cè)MVs中Annexins家族蛋白表達(dá)變化。（5）用p-NPP檢測(cè)MVs的ALP活性，然后將提取后的MVs在含有蔗糖的TBS中重懸，種在鋪有I型鼠尾膠原的24孔板中，加入礦化誘導(dǎo)液促使形成礦化結(jié)節(jié)，以檢測(cè)MVs的體外礦化能力。
　　結(jié)果：（1）茜素紅染色結(jié)果顯示礦化誘導(dǎo)組發(fā)生明顯礦化，產(chǎn)生大量礦化結(jié)節(jié)，對(duì)照組只有少量礦化；茜素紅定量結(jié)果顯示誘導(dǎo)組產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)

7、是正常對(duì)照組的6倍左右，說明我們成功構(gòu)建了Saos-2的體外礦化模型。（2）從Western Blot的結(jié)果我們可以看出隨著礦化的進(jìn)行TNC的表達(dá)量逐漸增加，在前期變化不明顯，在誘導(dǎo)9天時(shí)增加明顯。（3）RNAi后，從RT-qPCR的結(jié)果和Western Blot的結(jié)果可以看出加入干擾片段后TNC的表達(dá)量減少，達(dá)到了下調(diào)其表達(dá)的目的。（4）RNAi后，細(xì)胞培養(yǎng)3天后用RT-qPCR檢測(cè)ALP、COL1A1表達(dá)量，這兩個(gè)成骨標(biāo)志基因表達(dá)量

8、下降；ALP活性和染色顯示陰性對(duì)照組的ALP活性和表達(dá)量比加入干擾片段的兩組高。（5）Western Blot結(jié)果可以看出，在干擾后MVs上Anx家族蛋白的表達(dá)有一定程度的減少，但不是很明顯。下調(diào)TNC的表達(dá)后MVs的礦化能力明顯降低，說明TNC調(diào)控成骨細(xì)胞的礦化可能是通過調(diào)控MVs進(jìn)行的；陰性對(duì)照組與干擾組MVs的ALP活性變化明顯，說明該礦化的調(diào)控可能是通過調(diào)控MVs的ALP活性進(jìn)行的。
　　結(jié)論：TNC可以調(diào)控成骨細(xì)胞的礦化