健骨顆粒對(duì)成骨細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、目的 本課題以成骨細(xì)胞分化作為切入點(diǎn)，通過(guò)研究成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的敏感指標(biāo)核心結(jié)合因子（Cbfal）、Osterix（OSX）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（AKP）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）及其產(chǎn)物羥脯氨酸（HYP）和礦化結(jié)節(jié)的變化，旨在探討補(bǔ)腎健脾中藥——鍵骨顆粒對(duì)成骨細(xì)胞分化的干預(yù)作用，為中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥提供客觀的依據(jù)。 二、方法 1建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系：原代細(xì)胞用酶消化法從新生SD大鼠顱蓋骨獲取，

2、經(jīng)堿性磷酸酶染色鑒定后，取第三、四代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2健骨顆粒含藥血清制備：取3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為含藥血清組和生理鹽水血清組，每組10只，含藥血清組給予健骨顆粒2g·kg-1·d-1，空白血清組灌服生理鹽水2ml·d-1，二組均連續(xù)灌胃7天，腹主動(dòng)脈取血制備健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清。 3檢測(cè)指標(biāo)：MTT法檢測(cè)不同含藥血清濃度對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，得出最佳含藥血清濃度；以最佳濃度的含藥血清作用于成

3、骨細(xì)胞至7天，收集細(xì)胞液，以生理鹽水血清干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)成骨細(xì)胞OCN濃度，比色法測(cè)HYP、AKP含量；收集細(xì)胞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Cbfa1、ColⅠ、OSXmRNA表達(dá)：取第4代細(xì)胞按6×105/ml的密度接種于12孔板，連續(xù)觀察15天，采用茜素紅染色法染色礦化結(jié)節(jié)。 三、結(jié)果 1、MTT法檢測(cè)顯示健骨顆粒含藥血清濃度為20%時(shí)，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖速度最快，明顯快于同濃度生理鹽水血清組

4、。 2、鈣化結(jié)節(jié)觀察顯示：15%、20%、30%、生理鹽水組都在不同的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了結(jié)節(jié)，含藥血清20%組最先出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，15%、30%組次之。觀察還發(fā)現(xiàn)與生理鹽水血清組比較含藥血清組有結(jié)節(jié)數(shù)量增多的趨勢(shì)。 3、細(xì)胞液內(nèi)OCN含量：酶聯(lián)免疫吸附法顯示，隨天數(shù)的增加生理鹽水血清組與含藥血清組細(xì)胞液內(nèi)OCN含量均逐漸上升，第4天OCN含量最高，然后隨培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸下降，含藥血清組OCN含量均高于同濃度生理鹽水血清組，兩組

5、比較均有顯著性差異。 4、細(xì)胞液內(nèi)AKP、HYP含量：比色法顯示，含藥血清組和生理鹽水血清組細(xì)胞液內(nèi)AKP、HYP含量均隨天數(shù)的增加逐漸增多，但含藥血清組AKP、HYP含量均高于生理鹽水血清組，兩組比較有顯著性差異。 5、成骨細(xì)胞Cbfa1、ColⅠ、OSX基因mRNA表達(dá)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，前3天含藥血清組成骨細(xì)胞中Cbfa1基因mRNA表達(dá)水平均高于生理鹽水組，兩組相比有顯著性差異，第7天兩組之間無(wú)顯

6、著性差異。第1、2、3、7天含藥血清組成骨細(xì)胞中ColⅠ、OSX基因的mRNA表達(dá)水平均高于生理鹽水血清組，兩組相比有顯著性差異。 四、結(jié)論 1、補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒能提高體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞中AKP、HYP、OCN含量，增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，增強(qiáng)ColⅠ、Cbfa1、OSXmRNA的表達(dá)，說(shuō)明健骨顆粒具有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的作用。 2、健骨顆粒促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟的作用機(jī)制可能過(guò)程為：補(bǔ)腎健脾→上調(diào)最關(guān)鍵的特異性