類胡蘿卜素對(duì)成骨細(xì)胞代謝的調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　 骨折愈合及骨代謝消長(zhǎng)是國(guó)際骨科學(xué)領(lǐng)域中最為關(guān)注的一大類健康問(wèn)題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨生長(zhǎng)發(fā)育強(qiáng)勁衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切。腎后天之精來(lái)源于脾精的滋養(yǎng)，故脾精不足，腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)。而腎主骨生髓，髓生精血互化，血液運(yùn)行濡養(yǎng)賴于腎精元?dú)獾恼趄v氣化推動(dòng)。若腎精不足，可致氣化失源，無(wú)力溫育激發(fā)推動(dòng)臟氣，氣機(jī)升降出入失常，血失流暢，脈道澀滯乃至血瘀，反之血瘀有加重。腎虛，因此骨折愈合、骨的消長(zhǎng)主要與腎虛、脾虛、血瘀有關(guān)，以補(bǔ)腎、健

2、脾、活血為原則；而活性氧與中醫(yī)證型關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，腎虛、脾虛、血瘀均與活性氧代謝有關(guān)，因此中藥干預(yù)骨折愈合、骨代謝疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)性疾病等）的作用機(jī)理可能與中藥某些具有較強(qiáng)清除活性氧功能的成分有關(guān)。
　　 類胡蘿卜素是一大類廣泛分布、具極強(qiáng)抗氧化功能的化合物，屬食藥兼顧類化合物，其對(duì)自由基（尤其是O2-、OH-、1O2）的淬滅能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素E。雖然類胡蘿卜素研究始于19世紀(jì)50年代，而在其與骨折愈合、骨代謝方面的研究

3、一直無(wú)人問(wèn)津。上世紀(jì)90年代雖有關(guān)維生素A干預(yù)骨代謝的零星臨床報(bào)道，但直到2005年國(guó)際類胡蘿卜素科學(xué)年會(huì)上發(fā)表了一篇有關(guān)類胡蘿卜素與骨健康基礎(chǔ)研究報(bào)告后，世界機(jī)構(gòu)才開始關(guān)注這一領(lǐng)域中基礎(chǔ)性理論研究。就國(guó)內(nèi)此類研究而言，尤其是類胡蘿卜素中非維生素A源類化合物對(duì)骨折愈合、骨代謝調(diào)控的研究尚無(wú)報(bào)道。
　　 本課題研究目的通過(guò)從整體（D-半乳糖致衰老Wistar大鼠模型）-細(xì)胞（M3T3-E1成骨細(xì)胞模型）-分子（成骨細(xì)胞DNA）三個(gè)

4、水平層次、結(jié)合體內(nèi)（invivo）-體外（invitor）試驗(yàn)研究不同分子結(jié)構(gòu)類胡蘿卜素（β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素）順/反式異構(gòu)體對(duì)不同類型自由基（O2-、OH-、1O2）淬滅的效果，同時(shí)從基因、蛋白質(zhì)水平探索性研究了非維生素A源類胡蘿卜素（蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)）對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)理，為進(jìn)一步搞清此類化合物對(duì)骨代謝消長(zhǎng)、骨折愈合干預(yù)作用可能的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為開發(fā)應(yīng)用防治此類骨病

5、的中藥復(fù)方開辟新的途徑。
　　 研究?jī)?nèi)容與方法（1）制備、純化、鑒定6種不同類胡蘿卜素反式單體（2）體外誘導(dǎo)類胡蘿卜素反式單體異構(gòu)化為不同順式單體（3）不同類胡蘿卜素反式單體灌喂D-半乳糖致衰大鼠，對(duì)動(dòng)物整體抗氧化能力；各臟器分布情況（含量、異構(gòu)體比例等）、抗氧化指標(biāo)；血清代謝動(dòng)力學(xué)；骨代謝相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)（股骨長(zhǎng)度、重量、骨密度、骨鈣、骨磷、骨鎂、骨錳、羥脯氨酸含量、血鈣、血磷含量、ALP活性、骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)特點(diǎn)等）進(jìn)行測(cè)

6、定（4）不同類胡蘿卜素反式單體處理H2O2損傷的M3T3-E1成骨細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞存活率、SOD酶活性、ROS、LOP總量、DNA損傷以及細(xì)胞膜生物物理特性參數(shù)等進(jìn)行測(cè)定（5）利用化學(xué)發(fā)光法、生物微弱發(fā)光法進(jìn)行不同類胡蘿卜素順/反式單體體外淬滅不同自由基（O2-、OH-、1O2）效果的測(cè)定（6）不同非維生素A源類胡蘿卜素反式單體（蝦青素、斑蝥黃素、番茄紅素）處理M3T3-E1成骨細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、ALP活性以及

7、關(guān)鍵代謝調(diào)控基因（ALP、CollagenI、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL、RXR）進(jìn)行測(cè)定結(jié)果（1）整體水平：將制備得到的β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體分別灌喂D-半乳糖致衰老大鼠后，可以有效地降低血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c、LDL-c/HDL-c及各臟器的MDA，升高血清、各臟器的SOD、GSH-Px酶活性，提高機(jī)體總抗氧化能力。

8、同時(shí)也可增加D-半乳糖致衰老大鼠的股骨長(zhǎng)度、重量和骨密度，提高重要的骨礦物質(zhì)（鈣、磷、鎂、錳）、羥脯氨酸含量及其ALP活性，影響血鈣、磷的含量，改善骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物力學(xué)特點(diǎn)，減少衰老過(guò)程自由基對(duì)骨代謝的不良影響。
　　 （2）細(xì)胞水平：β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體可有效地抑制H2O2對(duì)成骨細(xì)胞膜的損傷，降低細(xì)胞ROS、LPO含量，增加SOD酶活性，減少DNA損傷，提高細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)

9、發(fā)現(xiàn)，蝦青素、斑蝥黃質(zhì)和番茄紅素在基因表達(dá)水平上對(duì)成骨細(xì)胞ALP、CollagenI、RUNX2、TGFβ1、VEGF、BMP2、IGF-I、OPG、RANKL均有調(diào)控作用，在蛋白質(zhì)水平對(duì)ALP、OPG以及總蛋白含量積累也有上調(diào)影響，且與相應(yīng)的mRNA水平基本一致。
　　 此外，在調(diào)控RXR受體表達(dá)方面，3種類胡蘿卜素與維生素A存在差異，這意味著非維生素A源類胡蘿卜素化合物可能會(huì)在成骨細(xì)胞膜上與某一特異性受體識(shí)別結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞代

10、謝途徑，激活或抑制某些關(guān)鍵性基因，對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化過(guò)程產(chǎn)生影響。同時(shí)由于3種類胡蘿卜素吸收與維生素D吸收對(duì)于RXR受體不存在競(jìng)爭(zhēng)，因此其攝入可能不會(huì)導(dǎo)致后者吸收障礙。
　　 （3）分子水平：制備得到的β，β-胡蘿卜素、蝦青素、番茄紅素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃素、葉黃素反式單體以及體外碘誘導(dǎo)下得到的不同順式異構(gòu)體對(duì)不同自由基（O2-、OH-、1O2）均有良好的淬滅效果，但就淬滅自由基類型而言：1O2>OH。>O2-；就類胡蘿卜素反式

11、單體淬滅能力而言：番茄紅素>蝦青素>斑蝥黃質(zhì)>葉黃素>玉米黃素>β，β-胡蘿卜素；就類胡蘿卜素順/反式單體淬滅能力而言：類胡蘿卜素反式單體>13-順式異構(gòu)體>11-順式異構(gòu)體>9-順式異構(gòu)體。
　　 此外，在體外不同類胡蘿卜素對(duì)成骨細(xì)胞DNA的復(fù)制具有一定的促進(jìn)作用，同時(shí)可有效地減低自由基對(duì)DNA的損傷影響。
　　 結(jié)論：
　　 （1）成功制備得到6種不同類胡蘿卜素的順/反式單體（2）成功建立一套整體、細(xì)胞、分子