Sprouty2介導(dǎo)的FoxO3a促腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察FoxO3a通過(guò)Sprouty2對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響，并探究相關(guān)作用機(jī)制，探尋膠質(zhì)瘤基因治療新的靶點(diǎn)。 方法: 1.FoxO3a-pcDNA3.1真核表達(dá)載體經(jīng)Nco I、Hind Ⅲ酶切后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。 2.體外培養(yǎng)的U251細(xì)胞被隨機(jī)分為四組：實(shí)驗(yàn)組，空載體組，脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將FoxO3a-pcDNA3.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，經(jīng)G418篩選

2、獲得穩(wěn)定表達(dá)非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細(xì)胞。經(jīng)4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)，分別于24h、48h、72h收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)FoxO3a、Sprouty2的表達(dá)情況，Hoechst33258染色試劑盒及FACS法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 3.構(gòu)建Sprouty2 siRNA；U251細(xì)胞被隨機(jī)分為四組：實(shí)驗(yàn)組，脂質(zhì)體組，siRNA陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組；Sprouty2 siRNA經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)

3、體轉(zhuǎn)染4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)的U251/FoxO3a細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Sprouty2的表達(dá)，Hoechst33258染色試劑盒及FACS法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果: 1.FoxO3a-pcDNA3.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細(xì)胞株。 2.U251細(xì)胞FoxO3

4、a T32位點(diǎn)磷酸化水平高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞。 3.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)U251/FoxO3a后24 h、48 h、72 h，實(shí)驗(yàn)組Sprouty2表達(dá)水平高于對(duì)照組；Sprouty2 siRNA轉(zhuǎn)染4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)的U251/FoxO3a細(xì)胞后24h、48h、72h，實(shí)驗(yàn)組Sprouty2表達(dá)水平低于對(duì)照組。 4.Hoechst33258染色、FACS

5、檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示：4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)U251/FoxO3a細(xì)胞后24h、48h、72h，實(shí)驗(yàn)組U251/FoxO3a細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組；Sprouty2 siRNA轉(zhuǎn)染4-OH Tamoxifen誘導(dǎo)的FoxO3a/U251細(xì)胞后24h、48 h、72 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于陰性對(duì)照組。 結(jié)論： 1.獲得穩(wěn)定表達(dá)非磷酸化型FoxO3a的U251/FoxO3a細(xì)胞株。 2.FoxO3a的轉(zhuǎn)錄活性