Egr-1介導膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)Survivin促進血管形成實驗研究.pdf

1、惡性腦膠質(zhì)細胞瘤是顱內(nèi)常見的原發(fā)腫瘤，外科手術(shù)結(jié)合術(shù)后放療、化療，患者的中位生存時間一般少于18個月。因此迫切需要對其發(fā)病機理及治療環(huán)節(jié)進行較為系統(tǒng)的研究，尋找新型的治療方式，突破目前治療中遇到的瓶頸，以提高惡性膠質(zhì)細胞瘤患者的生存時間和生活質(zhì)量。
　　血管形成是一個復(fù)雜的生理進程，是指誘導已經(jīng)存在的血管，形成新生血管的過程。正常條件下，血管形成被嚴格調(diào)控并在刺激因素和抑制因素之間維持一個動態(tài)平衡。當刺激因素占據(jù)優(yōu)勢地位（血管形成

2、啟動），就會導致一系列級聯(lián)反應(yīng)（基底膜降解，內(nèi)皮細胞遷移、增殖及管腔形成）的發(fā)生。膠質(zhì)細胞瘤屬于血管增殖極為活躍的實體瘤，血管形成在膠質(zhì)細胞瘤的進展中發(fā)揮重要作用。
　　Survivin是IAP家族最小的成員，具有抗細胞凋亡及促進有絲分裂的功能。并且Survivin在腫瘤組織中高表達、于正常的終末分化組織中為低表達的特點，使之有望成為腫瘤治療的新靶點。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin與膠質(zhì)細胞瘤的病理級別呈正相

3、關(guān)，和膠質(zhì)細胞瘤中的微血管密度亦呈正相關(guān)，并且干涉膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin，不僅可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，降低其在裸鼠中的成瘤性，并且可以降低移植瘤組織中的微血管密度，這提示我們在膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin有可能參與瘤組織中血管形成的調(diào)節(jié)。但是據(jù)此尚不能確定膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin對瘤組織內(nèi)血管形成的作用。根據(jù)以往文獻報道，野生型Survivin可以上調(diào)胰島素細胞中Egr-1的表達。Egr-1是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，很多促

4、血管形成因子的啟動子區(qū)都有Egr-1的結(jié)合位點。據(jù)此我們推測膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin可以通過Egr-1來調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞中促血管形成因子的表達及分泌，進而促進膠質(zhì)細胞瘤中的血管形成。
　　目的：探索膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin是否可以影響瘤組織中的血管形成，并探討其發(fā)揮作用的機制。
　　方法：采用脂質(zhì)體法，將Survivin的真核表達載體pcDNA3.1-Survivin，Egr-1的真核表達載體pcDNA3.1-Eg

5、r-1，同時攜帶Survivin和Egr-1shRNA表達框的真核表達載體pcDNA3.1-Survivin-EgrshRNA及空載體pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染SHG44細胞，將Survivin的干涉載體pRNAT-SurvivinshRNA、Egr-1的干涉載體pRNAT-Egr-1shRNA及無關(guān)插入序列載體Prnat-NSsi和空載體pRNAT-U6.1/Neo分別轉(zhuǎn)染U251細胞，通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同克隆的細胞系。分別采

6、用MTT法、Transwell小室、血管管狀形成實驗，檢測親代SHG44細胞、轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細胞、親代U251細胞、抑制Survivin的U251細胞對HUVECs增殖、遷移及形成血管功能的影響。采用qPCR檢測各組細胞中三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的mRNA水平，采用Westernblot檢測各組細胞中三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的蛋白表達水平，采用ELISA方法檢測三種促血管形成

7、因子VEGF、bFGF和PDGF在相應(yīng)細胞培養(yǎng)液上清中的水平。將各組細胞接種于裸鼠背部，構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，觀察各組瘤細胞的生長情況，并測定移植瘤體積，檢測瘤組織內(nèi)MVD，Ki67，Survivin，Egr-1及三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的表達情況。
　　結(jié)果：將HUVECs和膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)，強制表達Survivin的SHG44細胞對HUVECs增殖、遷移及血管形成的刺激作用明顯強于親代SHG44細胞，親代U2

8、51細胞對HUVECs增殖、遷移及血管形成的刺激作用明顯強于抑制Survivin表達的U251細胞。Westernblot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細胞中可以檢測到bFGF表達，未檢測出VEGF和PDGF表達，轉(zhuǎn)染空載體的SHG44細胞和親代SHG44細胞中始終未檢測出VEGF、bFGF和PDGF表達；轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細胞中可以檢測到VEGF和bFGF表達，未檢測出PDGF表達，轉(zhuǎn)染空載體的SHG44細胞和

9、親代SHG44細胞中始終未檢測出VEGF、bFGF和PDGF表達。qPCR檢測的VEGF、bFGF和PDGF轉(zhuǎn)錄水平，ELISA檢測相應(yīng)細胞培養(yǎng)液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量變化與Westernblot檢測的結(jié)果一致。Westernblot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉Survivin表達的U251細胞中VEGF、bFGF表達下調(diào)，PDGF表達無變化，轉(zhuǎn)染空載體、無關(guān)序列的U251細胞和親代U251細胞中VEGF、bFGF和PDGF表達

10、無變化；干涉Egr-1的U251細胞中VEGF和bFGF表達下調(diào)，PDGF表達無變化，轉(zhuǎn)染空載體、無關(guān)序列的U251細胞和親代U251細胞中VEGF、bFGF和PDGF表達無變化。qPCR檢測的VEGF、bFGF和PDGF轉(zhuǎn)錄水平，ELISA檢測相應(yīng)細胞培養(yǎng)液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量變化與Westernblot檢測的結(jié)果一致。Westernblot、qPCR和ELISA檢測的結(jié)果顯示，與強制表達Survivin的SHG4

11、4細胞相比，轉(zhuǎn)染既表達Survivin同時干涉Egr-1表達的SHG44細胞中bFGF明顯降低。將不同的細胞接種裸鼠后，轉(zhuǎn)染Survivin或者轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細胞生長速度明顯快于親代SHG44細胞。干涉Survivin的U251細胞與親代細胞相比，生長速度明顯減慢，干涉Egr-1的U251細胞與親代細胞相比的生長速度相比沒有差異。轉(zhuǎn)染既表達Survivin同時干涉Egr-1的SHG44細胞與強制表達Survivin的SHG4

12、4細胞相比，其生長速度明顯減慢。Ki67的免疫組化檢測結(jié)果顯示，與親代SHG44細胞相比，轉(zhuǎn)染Survivin或轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細胞中的Ki67陽性細胞增多，與親代U251細胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251細胞中Ki67陽性細胞減少，轉(zhuǎn)染既表達Survivin同時干涉Egr-1的SHG44細胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44相比Ki67陽性細胞減少。MVD結(jié)果表明，與親代SHG44細胞相比，轉(zhuǎn)染Sur

13、vivin或轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細胞中的MVD增多，與親代U251細胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251細胞中MVD減少，轉(zhuǎn)染既表達Survivin同時干涉Egr-1的SHG44細胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細胞相比MVD減少。半定量免疫組化評分結(jié)果證明，與親代SHG44細胞相比，轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細胞中VEGF、bFGF、PDGF表達上調(diào)，轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細胞中VEGF、bFG

14、F、PDGF表達上調(diào)；轉(zhuǎn)染既表達Survivin同時干涉Egr-1的SHG44細胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44相比，VEGF、bFGF、PDGF表達下調(diào)；與親代U251細胞相比，干涉Survivin的U251細胞中VEGF、bFGF和PDGF表達下調(diào)；干涉Egr-1的U251細胞中VEGF、bFGF和PDGF表達下調(diào)。
　　結(jié)論：膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin在體外可以促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及管狀形成等功能，在體內(nèi)可以提

15、高瘤組織內(nèi)MVD。這些作用的發(fā)揮是通過膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的Survivin上調(diào)促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的轉(zhuǎn)錄、表達及分泌實現(xiàn)的。Survivin發(fā)揮促進這些因子的表達及分泌的功能時，需要轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的介導。我們的實驗首次證明了膠質(zhì)瘤細胞中的Survivin，在轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的介導下，可以促進瘤細胞中VEGF、bFGF和PDGF等因子的表達及分泌，進而促進膠質(zhì)細胞瘤中的血管形成，這為抗Survivin的靶向治療提供了