Survivin基因和促血管形成因子表達及對腦膠質(zhì)瘤血管生成調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、血管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮著重要作用。目前的研究結(jié)果表明，如果沒有血管生成，原發(fā)性腫瘤的生長不會超過1～2mm3。
　　腫瘤血管生成過程中涉及到血管生成因子與血管生成抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡。目前已分離和純化了20多種血管生成因子，主要包括血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、酸性及堿性成纖維細胞生長因子(aFGF，bFGF)、血小板衍化生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、表皮生長因子(EGF)、血管生成

2、素(angiogenin)、胎盤生長因子(PIGF)、白介素-8和腫瘤壞死因子α(TNFα)等。
　　腫瘤治療的抗血管生成是近幾年的研究熱點，抗血管生成治療具有其他方法無可比擬的優(yōu)點：(1)抗血管生成治療作用具有放大效應(yīng)，因為一個血管內(nèi)皮細胞支持50～100個腫瘤細胞生長；(2)血管內(nèi)皮細胞暴露在血液中，藥物能夠直接發(fā)揮作用，所用藥物劑量小、療效高；（3）抗血管生成治療對正常內(nèi)皮細胞影響不大，具有良好的特異性；（4）血管內(nèi)皮細胞基

3、因表達相對穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。
　　本課題在前期研究中于國內(nèi)外首次證明：凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族的Survivin和腦膠質(zhì)瘤血管生成密切相關(guān)。然而，和腫瘤血管生成最密切的促血管生成因子在Survivin和腫瘤血管生成之間的作用機制如何？截至目前，還沒有這方面的研究報道。有關(guān)Survivin與腦膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)系以及和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）基因的表達調(diào)節(jié)作用的關(guān)系，國內(nèi)外也沒有研究報道。因此，Sur

4、vivin在腦膠質(zhì)瘤血管形成中的作用機制尚不清楚，有必要對Survivin與腦膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)系以及促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）基因的表達調(diào)節(jié)在其中的作用機制進行更深入的研究。
　　基于上述分析，本實驗首先研究了促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）對Survivin的mRNA和蛋白的表達調(diào)節(jié)作用，分析了促血管形成因子與人腦膠質(zhì)瘤細胞U251和SHG-44的Survivin基因表達的上調(diào)關(guān)系機制；進而，

5、構(gòu)建Survivin基因真核表達載體，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)的SHG-44/SVV細胞系，在體外實驗分別研究Survivin和促血管形成因子在人腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達變化的關(guān)系，進一步在體內(nèi)試驗觀察Survivin對人腦膠質(zhì)瘤細胞血管形成的生物學(xué)特性的影響。通過以上研究，初步探討了Survivin在人腦膠質(zhì)瘤血管形成中的作用和機理。
　　本課題擬從以下三個方面進行了具體的實驗研究：
　　1促血管形成因子對膠質(zhì)瘤細胞Survivin表達影響的

6、體外實驗
　　在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞（無Survivin表達）和U251細胞（高表達Survivin）中，分別加入適量的VEGF、bFGF和PDGF，于不同時間點（0h、3h、6h、12h、24h），分別采用實時定量RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法，檢測Survivin基因mRNA和蛋白表達水平的變化，并進行圖像處理和統(tǒng)計學(xué)分析，同時設(shè)立空白對照、陰性對照和內(nèi)對照（β-actin），觀察上述促血管

7、形成因子在人腦膠質(zhì)瘤細胞中是否能夠上調(diào)Survivin基因的表達。在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞中，分別和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）作用的不同時間點，均無Survivin基因和蛋白表達，和陽性對照組比較表達量均有顯著差異（P均<0.01）。在體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞中，分別和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）作用的不同時間點，均有大量Survivin基因和蛋白表達，和陽性對照組比較表達量均

8、無顯著差異（P>0.05）。以上研究結(jié)果表明，促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）能明顯上調(diào)人腦膠質(zhì)瘤U251細胞中Survivin基因和蛋白表達。對于無Survivin表達的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞，促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）無上調(diào)Survivin表達的作用。
　　2SHG-44/SVV細胞系的建立及Survivin基因?qū)Υ傺苄纬梢蜃樱╒EGF、bFGF和PDGF）表達影響的體外實驗
　　

9、設(shè)計合成擴增Survivin基因整個編碼區(qū)序列的特異性引物，采用RT-PCR方法從高表達Survivin基因的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞中克隆Survivin基因cDNA編碼區(qū)序列，構(gòu)建Survivin基因真核表達載體，對克隆產(chǎn)物進行基因序列分析，以驗證目的片段的正確性，同時行酶切鑒定。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染無Survivin基因表達的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin基因的SHG-44/SVV細胞系，同時設(shè)立轉(zhuǎn)染

10、空載體的SHG-44/Emy細胞。采用實時定量RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法，分別檢測SHG-44/SVV細胞系、SHG-44/Emy和SHG-44原型細胞中Survivin基因mRNA和蛋白的表達水平，并進行圖像處理和統(tǒng)計學(xué)分析，以證明SHG-44/SVV細胞系獲得特異的外源性Survivin基因的表達。并分別檢測上述促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）mRNA和蛋白在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細胞系

11、、SHG-44/Emy和SHG-44原型細胞中的表達水平，每項實驗分別設(shè)陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照（β-actin），對實驗結(jié)果進行圖像處理和統(tǒng)計學(xué)分析，以證明在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞中Survivin基因?qū)@3種促血管形成因子是否具有上調(diào)其表達作用。在SHG-44/SVV細胞系中，均有大量Survivin基因和蛋白表達，和陽性對照組比較Survivin表達量均有顯著差異（P均<0.01），驗證了SHG-44/SVV細胞系獲得了外源Sur

12、vivin基因，成功地建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)的SHG-44/SVV細胞系。在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細胞系中，進一步分別檢測促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）的mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白均有大量表達，和陽性對照組比較VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白表達量有顯著差異（VEGF、bFGF組P<0.01，PDGF組P<0.05）。以上結(jié)果提示：在體外培養(yǎng)的SHG-44/SVV細胞

13、系中，Survivin表達上調(diào)和促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）表達上調(diào)呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3Survivin基因在裸鼠人腦膠質(zhì)瘤組織中對促血管形成因子（VEGF、bFGF和PDGF）表達及對人腦膠質(zhì)瘤血管形成和腫瘤生長增殖影響的活體實驗
　　將SHG-44/SVV、SHG-44/Emy和SHG-44原型細胞分別接種于裸鼠背部皮下，每組細胞接種6只裸鼠，建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。定期觀察腫瘤生長情況，測

14、量腫瘤體積，觀察期滿后處死動物，取出瘤組織，稱瘤重。通過采用免疫組化方法檢測八因子相關(guān)抗原（FⅧRAg）的表達，以計算各組腫瘤標(biāo)本的微血管密度（MVD）。采用實時定量RT-PCR、免疫組化方法，分別檢測各組腫瘤標(biāo)本VEGF、bFGF和PDGFmRNA和蛋白的表達水平，每項實驗分別設(shè)陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照（β-actin），對實驗結(jié)果進行圖像處理和統(tǒng)計學(xué)分析。通過本實驗以證明在膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤中Survivin基因?qū)@3種促血管形成因

15、子是否具有上調(diào)其表達作用。結(jié)果顯示，與SHG-44/Emp和SHG-44原型細胞組裸鼠相比，SHG-44/SVV組裸鼠腫瘤形成時間明顯提前，腫瘤生長快，瘤體積及瘤重均明顯增加（P均<0.01）。采用免疫組化SABC方法檢測Survivin、FⅧRAg在各組腫瘤標(biāo)本中的表達，分別計算各組腫瘤組織的MVD。結(jié)果表明，與SHG-44/Emy和SHG-44原型細胞組相比，SHG-44/SVV組腫瘤組織Survivin蛋白表達明顯上調(diào)。上述研究結(jié)

16、果提示，Survivin基因可明顯上調(diào)人腦膠質(zhì)瘤細胞裸鼠移植瘤的VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白的表達水平，促進了血管形成，其機制與Survivin基因明顯上調(diào)促血管形成因子的表達水平有關(guān)。
　　綜上所述，Survivin可能是人腦膠質(zhì)瘤血管形成過程中的一個關(guān)鍵基因，其機制為促血管形成因子對Survivin基因表達有上調(diào)作用，Survivin基因表達正反饋作用于促血管形成因子，上調(diào)促血管形成因子的表達，進而促進了血管形