人腦膠質瘤中促血管生成素-2的表達與血管形成相關性研究.pdf

1、目的：膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，特別是膠質母細胞瘤的術后復發(fā)率高，五年生存率低。它是一種富含血管的惡性腫瘤，且具有浸潤性生長的特點，血管的生成有利于腫瘤的生長、侵襲和轉移。侵襲性生長是腦膠質瘤細胞療效差的主要原因之一，而新生血管是腫瘤侵襲性生長過程中的必然現(xiàn)象。故研究膠質瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移的特征有著積極的現(xiàn)實意義。腫瘤的生長、侵襲和轉移依賴于腫瘤性的血管生成。而腫瘤的血管生成又受血管生成促進因子和血管生成抑制因子的共

2、同調(diào)節(jié)。促血管生成素AngiopoietiFns(Angs)是近年發(fā)現(xiàn)的與血管生成有關的因子，包括Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4等，其中Ang2與血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)有協(xié)同作用，在腫瘤血管生成中起著至關重要的作用。膠質瘤是典型的血管依賴性實體腫瘤。因此研究Ang-2和VEGF相關的分子生物學機制，可以為治療腦膠質瘤提供新思路。本研究的目的是通過對腦膠質瘤中Ang-2、VEGF及微血管密度(MVD)進行檢測，探

3、討它們之間的關系及在膠質瘤生長、侵襲和轉移中的作用及與膠質瘤惡性程度與預后的關系。 方法：選取2003年～2004年于河北醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行腦膠質瘤手術切除的新鮮膠質瘤標本49例，其中男性患者27例，女性22例。年齡6-76歲，平均45.2±11.7歲。其中＜60歲者35例，＞60歲者14例。臨床癥狀出現(xiàn)時間5天～2年，平均兩個月。所有患者術前均未行化療、放療及免疫治療。腫瘤臨床病理按WHO(2000)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分

4、類標準進行分類和分級，其中Ⅰ級10例(毛細胞性星形細胞瘤8例，脈絡叢乳頭狀瘤2例)；Ⅱ級9例(纖維性星形細胞瘤4例，原漿性星形細胞瘤2例，少枝膠質細胞瘤2例，肥胖細胞性星形細胞瘤1例)；Ⅲ級13例(間變性星形細胞瘤11例，間變性室管膜瘤2例)；Ⅳ級17例(膠質母細胞瘤12例，髓母細胞瘤5例)。另取5例取自同期因急性顱腦損傷行內(nèi)減壓手術的正常腦組織作為對照，其中男3例，女2例。每例標本均分為兩部分：一部分于術中離體30分鐘內(nèi)取材，立即置入

5、液氮速凍，并保存于-80℃冰箱，用于RT-PCR；另一部分標本均用4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組織化學染色。每例標本做5μm厚連續(xù)切片備用，并做HE染色確定診斷。 免疫組織化學染色法檢測蛋白水平的表達：應用S-P免疫組織化學方法檢測促血管生成素-2、VEGF及微血管密度(Mcrovasculardensity,MVD)，每種免疫組化染色均設陽性和陰性對照。結果判定促血管生成素-2陽性染色均定位于腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞

6、的胞質中，陽性細胞成不均散分布。VEGF表達在膠質瘤細胞質中，呈棕黃色，不均散分布。以高倍視野(×400)下陽性細胞數(shù)量綜合判斷，采用半定量分析法。每張切片隨機選擇5個以上高倍視野，鏡下視野清晰，無壞死、出血，計數(shù)1000個腫瘤細胞的陽性率。每個玻片計數(shù)1000個腫瘤細胞，求出陽性細胞百分數(shù)，用標記指數(shù)(Labellingindex，LI)表示：LI(％)=陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞數(shù)×100％。同時分別將陽性腫瘤細胞分為4個等級：無陽性細胞

7、為“-”；陽性細胞＜30％為“+”；陽性細胞30％～60％為“++”；陽性細胞＞60％為“+++”。 所有結果應用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計處理，mRNA表達指數(shù)(RI)及標記指數(shù)(LI)用均數(shù)±標準差(X±S)表示。對結果采用t檢驗，方差分析，卡方檢驗，秩和檢驗及直線回歸及相關分析等方法。檢驗標準采用p＜0.05有統(tǒng)計學意義。 結果：本實驗共檢測了膠質瘤49例，正常腦組織5例作為對照，Ang-2、VEGF、MVD在

8、正常腦組織及不同惡性度膠質瘤中的表達以及它們之間的相關性如下： 1Ang-2陽性染色均定位于腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞質和胞核中，其中大部分在胞核表達，Ang-2蛋白在49例膠質瘤中均有表達，5例正常腦組織中Ang-2蛋白無陽性；在10例Ⅰ級膠質瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細胞的百分率均數(shù)為0.1788±0.0108；在9例Ⅱ級膠質瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細胞的百分率均數(shù)為0.2202±0.0083；在13例Ⅲ級膠質瘤中Ang-

9、2蛋白陽性腫瘤細胞的百分率均數(shù)為0.2809±0.0107；17例Ⅳ級膠質瘤中Ang-2蛋白陽性腫瘤細胞的百分率均數(shù)為0.3536±0.0068。且在高度惡性膠質瘤中Ang-2蛋白在腫瘤與正常腦組織交界處，腫瘤內(nèi)壞死組織周圍高表達，兩者周圍區(qū)低表達。由此可見膠質瘤組織中Ang-2陽性蛋白表達率明顯高于正常腦組織，且在惡性度高的膠質瘤明顯高于低度惡性的膠質瘤中的表達率。經(jīng)統(tǒng)計學X2檢驗分析其差別非常有顯著性P＜0.01。 2VEG

10、F表達與膠質瘤細胞質中，5例正常腦組織無VEGF表達VEGF表達陽性率為0.0895±0.0085，10例Ⅰ級膠質瘤中VEGF表達陽性率0.1812±0.0078，9例Ⅱ級膠質瘤中VEGF表達陽性率0.2302±0.0087，13例Ⅲ級膠質瘤中VEGF表達陽性率0.3491±0.0079，17例Ⅳ級膠質瘤中VEGF表達陽性率0.4377±0.0146。膠質瘤VEGF陽性表達率顯著高于正常腦組織，其表達在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各級膠質瘤之間有顯著

11、差異性，經(jīng)統(tǒng)計學X2檢驗分析其差別非常有顯著性P＜0.01。 3經(jīng)過微血管密度測定，正常腦組織和腫瘤組織間質中的血管內(nèi)皮細胞均有Ⅷ因子相關抗原表達，正常腦組織中微血管數(shù)量較少，形態(tài)規(guī)則，而腫瘤組織中微血管數(shù)量較多，形態(tài)不規(guī)則。檢測得到5例正常腦組織的MVD為6.2±1.5，10例Ⅰ級膠質瘤的MVD為13.4±1.6，9例Ⅱ級膠質瘤的MVD為29.02±1.8，13例Ⅲ級膠質瘤的MVD為48.2±1.2，17例Ⅳ級膠質瘤的MVD為

12、80.0±2.0。正常腦組織、Ⅰ到Ⅳ級膠質瘤中MVD逐漸增高，經(jīng)檢驗差異顯著P＜0.01。 4Ang-2、VEGF、MVD的相關性正常腦組織中Ang-2、VEGF、MVD不表達或者弱表達，所有膠質瘤中，隨著膠質瘤級別的升高，它們的陽性表達水平明顯升高。Ang-2表達與VEGF表達及MVD密切相關(p＜0.01)，Ang-2、VEGF、MVD在正常腦組織與不同級別的膠質瘤中的陽性表達率呈顯著正相關。 結論：Ang-2、VE