PKC-COX-2介導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人神經(jīng)膠質(zhì)瘤耐阿霉素細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性 目的： 建立人神經(jīng)膠質(zhì)瘤阿霉素耐藥細(xì)胞株SHG44/ADM，并初步探討其發(fā)生多藥耐藥的可能機(jī)制。 方法： 1、應(yīng)用阿霉素濃度遞增和間歇誘導(dǎo)法建立SHG44/ADM耐藥株。 2、采用CCK-8法檢測(cè)不同抗腫瘤藥物對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)，觀察凍存、撤藥對(duì)耐藥穩(wěn)定性的影響。 3、比較耐藥株

2、與親本細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞貼壁率、生長(zhǎng)曲線(xiàn)、群體倍增時(shí)間的差異。 4、雙層軟瓊脂實(shí)驗(yàn)測(cè)SHG44/WT和SHG44/ADM克隆形成率。 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)SHG44/WT和SHG44/ADM細(xì)胞周期。 6、RT-PCR檢測(cè)MDR-1、MRP1和LRP的mRMA表達(dá)量，免疫印跡法檢測(cè)MDR-1、MRP1、LRP、COX-2和PKC的蛋白表達(dá)量。 7、羅丹明實(shí)驗(yàn)測(cè)SHG44/WT和SHG44/ADM對(duì)藥物的攝

3、入、排出能力。 8、流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)SHG44/WT和SHG44/ADM細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果： 1、SHG44/ADM對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)為10.7，凍存對(duì)耐藥無(wú)明顯影響，而撤藥可降低耐藥性，而且SHG44/ADM對(duì)多種抗腫瘤藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。 2、SHG44/ADM相對(duì)于SHG44/WT細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，但生長(zhǎng)曲線(xiàn)緩慢，細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)(32.22±0.52h vs 26.67±

4、0.49 h)。 3、SHG44/WT親本細(xì)胞和SHG44/ADM耐藥細(xì)胞克隆形成率分別為：20％，52％，耐藥細(xì)胞的克隆形成率顯著增加。 4、相對(duì)于親本 SHG44/WT細(xì)胞(G1 期為31.40±5.7，S 期為19.60±3.5，G2/M 期為39.3±4.9)，SHG44/ADM 耐藥細(xì)胞(G1 期為45.47±6.8，S 期為35.73±5.3，G2/M 期7.8±2.6)的G1，S期所占比例增加，G2 期所占

5、比例減少。 5、RT-PCR檢測(cè)SHG44/ADM耐藥細(xì)胞株MDR-1的mRMA表達(dá)量明顯增強(qiáng)，而MRP1、LRP無(wú)明顯變化。 6、免疫印跡發(fā)現(xiàn)SHG44/ADM耐藥細(xì)胞株MDR1表達(dá)明顯增強(qiáng)，而MRP1和LRP表達(dá)無(wú)明顯變化，COX-2和PKC口的蛋白表達(dá)量增強(qiáng)。 7、SHG44/ADM對(duì)羅丹明攝入減少，排出增多。 8、熒光顯微鏡分析表明ADM對(duì)耐藥細(xì)胞SHG44/ADM的凋亡率明顯減少，加入MDR1抑

6、制劑干預(yù)后可明顯增加ADM對(duì)SHG44/ADM細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)論： 1、成功建立人神經(jīng)膠質(zhì)瘤阿霉素耐藥細(xì)胞株SHG44/ADM。 2、SHG44/ADM耐藥機(jī)制可能與MDR1的表達(dá)增加，抗癌藥物攝入減少，外排增多，減少藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用相關(guān)。 3、阿霉素耐藥細(xì)胞株SHG44/ADM的COX-2和PKC□的蛋白表達(dá)量增強(qiáng)。 第二部分PKC、COX-2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞多藥耐藥中的作用及其機(jī)制

7、的研究 目的： 探討PKC□、COX-2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞多藥耐藥中的作用，分析PKC□、COX-2、MDR1三者之間的關(guān)系，揭示人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥的機(jī)制。 方法： 1、采用CCK-8法檢測(cè)阿霉素對(duì)不同處理方式人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖作用影響，計(jì)算半數(shù)抑制率(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)。 2、臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)分析存活細(xì)胞和死亡細(xì)胞的數(shù)目。 3、免疫印跡法檢測(cè)MDR-1、COX-2和

8、PKC□的蛋白表達(dá)量4、激酶分析PKC的活性。 5、酶聯(lián)免疫分析PGE2的生成量。 6、熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度。 7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1、與SHG44/WT細(xì)胞相比，SHG44/ADM 細(xì)胞對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率增高(P<0.05)，PKC□蛋白表達(dá)和 PKC活性增加，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量也增加，MDR1蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)阿霉素

9、濃度降低，10□g/ml 阿霉素處理細(xì)胞后凋亡率減少。用10□M濃度的PKC抑制劑Staurosporine干預(yù)SHG44/ADM后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達(dá)增加但PKC活性明顯降低，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率增加(均相對(duì)于SHG44/ADM細(xì)胞)。 用25□M濃度的COX-2特異性抑制劑NS398處

10、理SHG44/ADM細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達(dá)和PKC活性無(wú)明顯變化，COX-2蛋白表達(dá)增加但PGE2生成量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率增加(均相對(duì)于SHG44/ADM 細(xì)胞)。 2、與SHG44/WT細(xì)胞相比，100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率增高(P<0.05)，

11、PKC□蛋白表達(dá)和PKC活性增加，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量也增加，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度降低，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率減少。 用10□M 濃度的PKC抑制劑Staurosporine干預(yù)100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達(dá)增加但 PKC 活性明顯降低(P<0.01)，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉

12、素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率增加(均相對(duì)于100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細(xì)胞)。用25□M濃度的COX-2特異性抑制劑NS398處理100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達(dá)和PKC活性無(wú)明顯變化，COX-2蛋白表達(dá)增加但 PGE2 生成量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率增加

13、(均相對(duì)于 100ng/mlPMA 處理的SHG44/WT細(xì)胞)。 3、與SHG44/WT細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率明顯增高(P<0.01)，PKC□蛋白表達(dá)和PKC活性無(wú)明顯變化，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量顯著增DH(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度明顯降低，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率明顯減少。 用10□M濃

14、度的PKC抑制劑Staurosporine干預(yù)轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化，PKC口蛋白表達(dá)增加但PKC活性降低，COX-2蛋白表達(dá)和PGE2生成量無(wú)變化，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度無(wú)明顯變化，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率無(wú)明顯變化(均相對(duì)于轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細(xì)胞)。 用25□M濃度的COX-2特異性

15、抑制劑NS398處理轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV -COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細(xì)胞后其對(duì)阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，PKC□蛋白表達(dá)和PKC活性無(wú)明顯變化，COX-2蛋白表達(dá)增加但PGE2生成量明顯減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細(xì)胞后其凋亡率明顯增加(均相對(duì)于轉(zhuǎn)染10□g/ml pCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細(xì)胞)。 結(jié)論： 1、PKC□蛋白表達(dá)和PKC