神經(jīng)膠質(zhì)瘤外泌體介導調(diào)節(jié)性B細胞的作用研究.pdf

1、侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學標志，也是導致腫瘤治療失敗和復發(fā)的重要原因之一。高度侵襲性是惡性膠質(zhì)瘤的重要病理學特征，瘤體邊界不清致使手術(shù)完整切除難度增大，從而導致腫瘤很快復發(fā)，這是患者預后差，復發(fā)率、死亡率高的主要原因。腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，國內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的35％～60％，5年生存率僅為20％～30％，是神經(jīng)外科臨床工作中面臨的最嚴重的腫瘤之一。對腦膠質(zhì)瘤的治療措施，傳統(tǒng)上仍然以手術(shù)為最重要的手段，但由于膠

2、質(zhì)瘤多為浸潤型生長，單純的手術(shù)治療后，很容易復發(fā)，療效并不能使人滿意。由于腫瘤細胞存在放療抗拒，術(shù)后放療尚不能殺滅殘余的腫瘤細胞，因此研究腫瘤細胞是通過怎樣的機制逃避放療的殺傷和如何降低此種機制的作用，對提高放療在膠質(zhì)瘤治療中的療效有很大的必要性。
　　腫瘤細胞的免疫逃避是指其通過多種方式逃避機體的免疫識別和攻擊，例如:細胞表面標志物的改變，包括腫瘤細胞表面的MHCⅠ類分子表達下降或者缺失、腫瘤抗原的變異、FAS系統(tǒng)的作用、B7分

3、子的表達異常等。腫瘤來源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等，其可以影響DC細胞及T細胞的成熟活化。腫瘤微環(huán)境誘導T細胞功能障礙，其中主要是通過受體/配體結(jié)合的方式釋放抑制性的信號，降低T細胞的功能。T細胞功能的障礙，會導致機體免疫減弱。
　　PIGF在癌變的情況下會引起高表達，同時它的相關(guān)受體VEGFR1的表達也會提高。PIGF在多種腫瘤中明顯上升，可以作為某些癌癥的指標性物質(zhì)。PIGF不僅可以刺激血管源細胞形成

4、新血管，而且PIGF可以直接作用于腫瘤細胞，損傷DC細胞，從而促進腫瘤的生長，也可以刺激骨髓中血管生成祖細胞轉(zhuǎn)移向腫瘤病灶。加入PIGF抗體在體內(nèi)不僅可以阻止新血管的生成，還可以刺激己生成血管的退化。最近研究報道顯示PIGF也參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理和免疫調(diào)節(jié)過程。
　　我們假設膠質(zhì)瘤分泌的PIGF通過外泌體作用于膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中的B細胞，使B細胞能夠表達TGF-β，轉(zhuǎn)化為TGF-β(+)的Bregs細胞，Bregs細胞可以特異性

5、的抑制膠質(zhì)瘤患者CD8(+)T細胞的增殖和活性，從而膠質(zhì)瘤細胞逃避免疫監(jiān)視向正常組織侵襲擴散。
　　通過本研究證明:
　　1、從膠質(zhì)瘤組織中分離純化的惡性膠質(zhì)瘤細胞（WHOⅢ～Ⅳ級）在體外培養(yǎng)后，細胞內(nèi)PIGF mRNA和蛋白有表達，當用不同濃度的PMA刺激后PIGF隨其濃度增加而增加。表明惡性膠質(zhì)瘤細胞中有PIGF表達。
　　2、密度梯度離心分離膠質(zhì)瘤細胞上清中的外泌體，LAMP-1特異性驗證外泌體后，裂解外泌體后可

6、檢測出P1GF蛋白，表明膠質(zhì)瘤細胞可以表達PIGF，并且其外泌體中也含有P1GF蛋白
　　3、正常人全血中分離獲得Na(i)ve B細胞(CD19+ IL-7R+ CD45+)，將收集的膠質(zhì)瘤外泌體用CSFE標記后與Naive B細胞共培養(yǎng)，免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Naive B細胞可以捕獲膠質(zhì)瘤外泌體;進一步將捕獲膠質(zhì)瘤外泌體的Naive B細胞，用單價PIGF和其抑制劑的Naive B細胞為對照，結(jié)果顯示:不同濃

7、度外泌體刺激的B細胞隨外泌體濃度的升高TGF-β mRNA和蛋白都增高，單加PIGF也可使Naive B細胞表達TGF-β增加。表明攜帶PIGF的膠質(zhì)瘤外泌體可以被Naive B細胞捕獲，捕獲后的Naive B細胞可特異表達TGF-β，且與PIGF調(diào)控有關(guān);即攜帶PIGF的外泌體可以將膠質(zhì)瘤病灶微環(huán)境中NaiveB細胞轉(zhuǎn)化為TGF-β(+)Bregs細胞。
　　4、將膠質(zhì)瘤組織中分離的B細胞、膠質(zhì)瘤患者外周血中的B細胞以及刺激轉(zhuǎn)化

8、的TGF-β(+)Bregs細胞分別用CSFE標記，提取膠質(zhì)瘤組織內(nèi)含物，10mg/ml的膠質(zhì)瘤組織提取物分別刺激三種獲得的B細胞，以10mg/ml BSA為陰性對照，5％ CO237℃孵箱培養(yǎng)3天后流式檢測三種B細胞增殖程度，結(jié)果表明:91.2％的組織來源B細胞增殖和8.14％的外周血B細胞增殖，約有60.8％的Bregs細胞得到增殖，結(jié)果顯示增殖的B細胞具有膠質(zhì)瘤特異性，膠質(zhì)瘤特異性Bregs細胞可能存在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤患者的外周

9、循環(huán)系統(tǒng)中
　　5、 從膠質(zhì)瘤患者全血中密度梯度離心分離PBMC后，接種75cm細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h后，將貼壁細胞與非貼壁細胞分開培養(yǎng)，加入不同細胞刺激因子培養(yǎng)7天獲得DC細胞和T細胞，再采用磁珠法分離純化CD8(+) CD25(-)T細胞。
　　將獲得的CD8(+) CD25(-)T細胞用CSFE標記后，按30萬:20萬比例與DC細胞混合接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，10mg/ml膠質(zhì)瘤組織提取物，陰性對照加入10mg/ml

10、BSA，然后加入20萬誘導Bregs細胞、Naive B細胞以及誘導Bregs細胞先與膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)后刺激3天，不加B細胞為對照。結(jié)果顯示:，流式細胞結(jié)果以CSFE標記細胞設門，BSA刺激的CD8+T細胞增殖2.18％，膠質(zhì)瘤提取物刺激的CD8+T細胞增殖23.0％，提示其中有一部分為膠質(zhì)瘤特異性CD8+T細胞擴增;膠質(zhì)瘤特異性CD8+T細胞可被膠質(zhì)瘤特異性誘導Bregs細胞抑制活性，CD8+T細胞增殖為2.11％，天然B細胞則不能抑

11、制CD8+T細胞增殖為30.2％。誘導Bregs細胞與T/DC細胞相同條件分開培養(yǎng)后再混合也可以抑制，CD8+T細胞增殖3.33％。膠質(zhì)瘤提取物培養(yǎng)刺激膠質(zhì)瘤患者CD8+T細胞可以分泌顆粒酶B和穿孔素，當Bregs細胞存在時也可以抑制其分泌。表明攜帶PIGF外泌體誘導的TGF-β(+)Bregs細胞具有特異性抑制膠質(zhì)瘤CD8(+)T細胞增殖，同時穿孔素與顆粒酶B檢測結(jié)果顯示Bregs細胞也可抑制CD8(+)T細胞的殺傷活性。