LeT-7b調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥的分子機理研究.pdf

1、背景:
　　膠質(zhì)瘤占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％左右，即使經(jīng)過廣泛切除、放射治療和化學(xué)治療后，病變?nèi)匀痪哂芯植壳忠u性，容易復(fù)發(fā)。并且，高級別膠質(zhì)瘤(間變型星形細(xì)胞瘤WHOm;多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤WHOW)患者的預(yù)后情況依然不佳。因此，臨床上期待有更加行之有效的治療方式。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守、長度很短的非編碼調(diào)控單鏈RNA，約20nt-24nt，通過與目標(biāo)mRNA互補配對導(dǎo)致mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯誘導(dǎo)基因沉默

2、。miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育、造血、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、癌癥的發(fā)生、發(fā)展。
　　目前，大量研究表明miRNA在腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥機制中扮演了重要的角色。
　　目的:
　　本研究通過檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251及順鉑耐藥株U251/CDDP的microRNA的表達差異，探討microRNA與膠質(zhì)瘤化療耐藥的關(guān)系及機理。
　　方法:
　　1、應(yīng)用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，采用順鉑劑

3、量梯度爬升篩選方法，誘導(dǎo)耐藥膠質(zhì)
　　瘤細(xì)胞株;MTT法檢測U251/CDDP相對于其親代細(xì)胞U251的耐藥性和耐藥倍數(shù);應(yīng)用microRNA表達譜芯片對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251及其耐藥模型251/CDDP的microRNA表達譜進行檢測，篩選出人膠質(zhì)瘤耐藥相關(guān)的microRNA;應(yīng)用real-timePCR方法對microRNA表達譜芯片檢測出的差異表達microRNA進行驗證;應(yīng)用化學(xué)合成法對篩選出的差異表達microRNA進行

4、體外合成，轉(zhuǎn)染至U251、U251/CDDP耐藥模型，觀察其對逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用。
　　2、轉(zhuǎn)染let-7b類似物至U251、U251/CDDP細(xì)胞，應(yīng)用Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白和分子Bcl-2、Bax、Caspase-3水平;Annexin-FITC染色檢測細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化;通過生物信息軟件預(yù)測let-7b的靶基因，確定let-7b的靶基因是CCND1，Western-blot檢測轉(zhuǎn)染后ccND

5、1、ppRb蛋白質(zhì)的改變情況;在U251、U251/CDDP細(xì)胞中，通過Western-blot檢測siRNA-CCND1轉(zhuǎn)染后的CCND1、ppRb蛋白表達情況，Annexin-FITC染色檢測細(xì)胞
　　凋亡;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:
　　1、我們誘導(dǎo)獲得的耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251/CDDP對順鉑半數(shù)抑制濃度(IC50)較親代U251增加了3.1倍分別是1.4±0.1ug/ml，4.4±0.9ug/m

6、l)。microRNA芯片的結(jié)果顯示耐藥株U251/CDDP與親代細(xì)胞系U251比較有23個microRNA高表達，34個microRNA低表達;RT-PCR的結(jié)果進一步證實miR-182、miR-224在U251/CDDP中顯著上調(diào)，而Let-7b、miR-125b、miR-107、miR-203在U251/CDDP中顯著下調(diào)。在U251細(xì)胞中，聯(lián)合-應(yīng)用let-7b、miR-125b、miR-107、miR-203、miR-182、

7、miR-224和化療藥物cisplatin(CDDP)的IC50分別為0.63±0.09、1.47±0.06、1.33±0.07、1.1±0.02、1.17±0.10、0.77±0.07ug/ml;在U251/CDDP細(xì)胞中，聯(lián)合應(yīng)用let-7b、miR-125b、miR-107、miR-203、miR-182、miR-224和化療藥物cisplatin(CDDP)的IC50分別1.62±0.03、5.52±0.47、5.87±1.56

8、、3.72±0.96、2.58±0.22、2.74±0.59ug/ml。基于Ic50值，在U251、U251/CDDP細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染let-7b使其對化療藥物的敏感性提高2--3倍。綜合前面的結(jié)果，我們得出在U251、U251/CDDP中的microRNA表達存在差異，let-7b在膠質(zhì)瘤耐藥機制中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　2、過表達let-7b對Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表達無明細(xì)影響;聯(lián)合應(yīng)用let-7b和化

9、療藥物順鉑可顯著抑制Bcl-2的表達，增加Bax的表達，使caspase-3活性顯著增加，從而促進了細(xì)胞的凋亡;let-7b引起G0/G1期停滯，促進細(xì)胞的凋亡;Let-7b和siRNA-CCND1均可抑制CCND1和ppRb的蛋白表達，而siRNA-CCND1亦可引起G0/G1期停滯，促進細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、U251/CDDP和U251的microRNA的表達存在著差異，提示microRNA參入膠質(zhì)瘤化療耐藥，

10、為進一步研究microRNA在膠質(zhì)瘤耐藥機制中的作用打下基礎(chǔ)。
　　2、轉(zhuǎn)染let-7b的類似物至U251、U251/CDDP細(xì)胞系可以增加U251、U251/CDDP的化療敏感性。
　　3、Let-7b可能通過調(diào)節(jié)其靶基因CCND1的蛋白表達，調(diào)節(jié)U251、U251/CDDP細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　4、成功構(gòu)建了靶向CCND1的siRNA表達載體，si-CCND1可以抑制CCND1、ppRb蛋白的表達，產(chǎn)生G0