膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、治療的靶細(xì)胞與靶分子研究.pdf

1、第一部分逆分化細(xì)胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、治療的靶細(xì)胞 [目的]探討B(tài)TSCs體外分化過程中的回逆現(xiàn)象，為研究其分化抑制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 [方法]利用CD133免疫磁珠篩選系統(tǒng)，從腫瘤組織中分離獲得CD133+細(xì)胞（BTSCs），分成4組進(jìn)行培養(yǎng)：（1）含10%胎牛血清（FCS）；（2）10%FCS+VPA；（3）無FCS+生長因子；（4）無FCS+生長因子+VPA。取不同時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞，相差顯微鏡觀察其形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢

2、測與分化相關(guān)的標(biāo)志物、細(xì)胞周期和DNA倍體變化；免疫激光共聚焦分析與分化相關(guān)標(biāo)志物的共表達(dá)情況。 [結(jié)果]無FCS條件下培養(yǎng)的BTSCs呈懸浮球狀生長，高表達(dá)CD133和Nestin，不表達(dá)GFAP和β—TubulinⅢ，G0/G1期細(xì)胞占大多數(shù)，G2/M期細(xì)胞接近0%，DNA都是異倍體，對VPA反應(yīng)不敏感。含F(xiàn)CS培養(yǎng)原本懸浮的細(xì)胞約4h開始貼壁，均呈圓形。此后逐漸向多形性分化，至7d時(shí)分化的細(xì)胞部分又返回至圓形，至10d～2

3、1d時(shí)，有的還能重新恢復(fù)球形并呈懸浮生長。培養(yǎng)3d、7d、10d和21d時(shí)，CD133、Nestin陽性細(xì)胞數(shù)先降后升，GFAP+和β—TubulinⅢ+細(xì)胞數(shù)始終處于較低水平。含F(xiàn)CS培養(yǎng)液中加入VPA，細(xì)胞形態(tài)上未見上述的回逆現(xiàn)象，CD133和Nestin表達(dá)的先降后升現(xiàn)象消失，GFAP和β—TubulinⅢ在第7d以后表達(dá)明顯升高，但極大部分細(xì)胞共表達(dá)Nestin。而神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）在含F(xiàn)CS培養(yǎng)至10d時(shí)即以GFAP和β—

4、TubulinⅢ表達(dá)為主，未見CD133+細(xì)胞。此外，含血清培養(yǎng)時(shí)BTSCs仍以異倍體為主，含少量的G2/M期細(xì)胞，加VPA誘導(dǎo)后細(xì)胞周期和DNA倍體變化不明顯。 [結(jié)論]BTSCs在含血清條件下培養(yǎng)出現(xiàn)盼多向分化表型不穩(wěn)定，時(shí)有去分化所導(dǎo)致的回逆。加入誘導(dǎo)分化劑VPA培養(yǎng)，雖然能阻止回逆現(xiàn)象出現(xiàn)，并有代表星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)上升，但因其共表達(dá)Nestin而仍屬于未完全分化細(xì)胞，表明BTSCs分化始終處于受抑狀態(tài)。

5、 第二部分p18INK4c基因失活參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展 [目的]探討p18INK4c基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。 [方法]分別用RT—PCR和免疫組化檢測人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織中p18INK4c基因的表達(dá)變化；MS—PCR分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞中p18INK4c基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；通過測序分析p18INK4c基因的序列變化；梅建真核表達(dá)載體pcDNA—p18INK4c，脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人腦膠

6、質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44，RT—PCR檢測基因表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖周期變化。 [結(jié)果]8株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中5株細(xì)胞不表達(dá)p18INK4c基因，其中2株中基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)；3株細(xì)胞表達(dá)p18INK4C基因，基因啟動(dòng)子區(qū)都呈去甲基化。68例人腦膠質(zhì)瘤組織中22例不表達(dá)、46例表達(dá)p18蛋白。BTSCs中p18INK4c表達(dá)缺失。轉(zhuǎn)染p18INK4c基因后，SHG44細(xì)胞中出現(xiàn)明顯p18INK4c表達(dá)，細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)

7、胞增加，S期細(xì)胞減少。 [結(jié)論]部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織中p18INK4c基因表達(dá)缺失，啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的原因之一。p18INK4c基因失活參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程。 第三部分誘導(dǎo)分化治療人腦膠質(zhì)瘤的靶細(xì)胞與靶分子 [目的]探討丙戊酸鈉誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化時(shí)作用的靶細(xì)胞和靶分子。 [方法]丙戊酸鈉治療位于裸小鼠皮下的可移植性人腦膠質(zhì)瘤，半定量RT—PCR檢測移植瘤中HDAC1和Tob的表達(dá)；

8、CD133免疫磁珠分離膠質(zhì)瘤組織中的CD133+細(xì)胞，在分別含血清或不含血清加生長因子的條件下培養(yǎng)，加丙戊酸鈉作用21d，流式細(xì)胞儀檢測和共聚焦顯微鏡觀察分化標(biāo)志物表達(dá)。 [結(jié)果]丙戊酸鈉能明顯抑制位于裸小鼠皮下移植瘤的增殖，使HDAC1表達(dá)下降，Tob表達(dá)升高。流式細(xì)胞儀檢測丙戊酸鈉作用21d的細(xì)胞，在含血清條件下，GFAP或β—tubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，而無血清加生長因子條件下兩標(biāo)志物表達(dá)均無顯著差異；共聚焦顯微鏡

9、觀察顯示上述的GFAP+或β—tubulinⅢ+細(xì)胞共表達(dá)Nestin。 [結(jié)論]VPA逆轉(zhuǎn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化抑制的靶分子有HDAC1和Tob，靶細(xì)胞為處于分化過程中的腦腫瘤干細(xì)胞。 第四部分ABCG2和MGMT基因啟動(dòng)子甲基化異常與膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥 [目的]分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞中耐藥基因ABCG2和MGMT啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)之間的關(guān)系。 [方法]RT—PCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ABCG2和MGMT的表達(dá)，MS—

10、PCR分析基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，用去甲基化試劑5—氮—脫氧胞苷處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后分析基因表達(dá)變化。 [結(jié)果]8株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有6株細(xì)胞表達(dá)ABCG2：其中5株細(xì)胞中ABCG2基因呈去甲基化，1株甲基化與去甲基化共存；2株細(xì)胞不表達(dá)ABCG2，其中1株甲基化與去甲基化共存，1株沒有檢測出甲基化和去甲基化產(chǎn)物。5株細(xì)胞表達(dá)MGMT，3株細(xì)胞不表達(dá)，其中5株細(xì)胞中MGMT為去甲基化，4株為高甲基化。 [結(jié)論]膠質(zhì)瘤細(xì)