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文檔簡介
1、本研究分為四部分: 第一部分、膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞長期培養(yǎng)及其特征分析 目的:以短期培養(yǎng)為主的人膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞(human Glioma Stem Cells/Progenitors,hGSCPs)研究進(jìn)展迅速,但各家報(bào)告的生物學(xué)特征不盡一致,建立一個(gè)生物學(xué)特征相對(duì)穩(wěn)定盼永生化細(xì)胞系勢(shì)在必行,可為深入探討膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。 方法:將同一患者初發(fā)膠質(zhì)瘤和復(fù)發(fā)的播散灶內(nèi)的腫瘤組織制成單細(xì)胞,用CD13
2、3—免疫磁珠分選陽性細(xì)胞,在干細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)和實(shí)時(shí)液氮凍存、復(fù)蘇后再培養(yǎng)。并根據(jù)無限增殖、多向分化等干細(xì)胞必備的指標(biāo)進(jìn)行鑒定。再用細(xì)胞擴(kuò)增、分化走向、分子和細(xì)胞遺傳、致瘤性等指標(biāo)觀察其生物學(xué)特征。 結(jié)果:從原發(fā)和復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤組織中分離得到的CD133+細(xì)胞,分別在體外連續(xù)培養(yǎng)了58個(gè)月和64個(gè)月,液氮凍存后復(fù)蘇仍能保持無限增殖和多向分化的特征不變。在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中呈球狀生長,能擴(kuò)增、少分化;在含血清培養(yǎng)基中培
3、養(yǎng)能分化成多形性瘤細(xì)胞,貼壁生長無接觸抑制。免疫共聚焦結(jié)果顯示:腫瘤球體中CD133+細(xì)胞占少數(shù),Nestin+細(xì)胞占多數(shù);貼壁分化細(xì)胞中Nestin+細(xì)胞占絕對(duì)多數(shù),即使有GFAP+和β—TubulinⅢ+細(xì)胞出現(xiàn),但都共表達(dá)Nestin。球體細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的DNA和染色體顯帶都為異倍體。腫瘤球裸小鼠原位移植瘤原發(fā)為局部侵襲性生長,而復(fù)發(fā)者為播散性生長,并廣泛浸潤軟腦膜。 結(jié)論:建立了來自同一患者兩株能在體外長期傳代培養(yǎng),保持
4、無限增殖、多向分化潛能不變的人膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞系,不僅有利于進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的特性和機(jī)制,還為研究其播散性復(fù)發(fā)等機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 第二部分、原發(fā)和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞在裸小鼠腦內(nèi)移植瘤的特征 目的:人源膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞(human Glioma Stem Cells/ProgeIutors,hGSCPs)能分化成親本腫瘤細(xì)胞的全部亞型,在免疫缺陷動(dòng)物腦內(nèi)具有高致瘤性已得到公認(rèn),但其侵襲性與親本腫瘤的關(guān)系以
5、及GSCPs與移植瘤組織中血管細(xì)胞的關(guān)系尚未明確。本研究探討源自同一患者原發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤組織的GSCPs在裸小鼠顱內(nèi)原位移植瘤的特征以及GSCPs移植瘤組織中的腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系,旨在證明GSCPs裸小鼠原位移植瘤的侵襲性與親本腫瘤的關(guān)系和GSCPs在腦腫瘤組織重構(gòu)中所起的作用。 方法:將已在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的原發(fā)和復(fù)發(fā)hGSCPs球在立體定向儀輔助下接種到裸小鼠右腦尾狀核。實(shí)驗(yàn)鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)時(shí)處死,取移植瘤組織常規(guī)石蠟包
6、埋、切片、HE、人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)和基質(zhì)金屬蛋白酶—1(matrix metalloproteinase—1,MMP1)染色,觀察其致瘤率、侵襲性和血管來源細(xì)胞。 結(jié)果:所接種的40只裸小鼠在30天內(nèi)全部因腫瘤而發(fā)病。無論是原發(fā)還是復(fù)發(fā)hGSCPS在裸小鼠腦內(nèi)接種部位里浸潤性生長的同時(shí),還散布于其它區(qū)域。但兩者的侵襲形式不盡相同,原發(fā)者在接種側(cè)半球,呈團(tuán)塊,局限于腦實(shí)質(zhì);復(fù)發(fā)
7、者,還浸潤軟腦膜和對(duì)側(cè)半球,呈粟粒樣分布。MMP1+細(xì)胞的分布,復(fù)發(fā)者比原發(fā)者要密集得多。HLA染色顯示移植瘤中存在人源腫瘤細(xì)胞直接構(gòu)成的血管。 結(jié)論:hGSCPs除了具有高致瘤性,還具有高侵襲性。復(fù)發(fā)的hGSCPs侵襲性更強(qiáng),除了與MMP1高表達(dá)有關(guān),還說明hGSCPs在侵襲性上具有親本腫瘤特異性。在hGSCPS的裸小鼠移植瘤中,腫瘤細(xì)胞在宿主腦內(nèi)廣泛分布并構(gòu)成了血管。GSCPs可能轉(zhuǎn)分化成腫瘤血管細(xì)胞,在腦膠質(zhì)瘤組織重構(gòu)中起
8、重要作用。 第三部分、克隆基因工程鼠的膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞和神經(jīng)干/祖細(xì)胞 目的:據(jù)推測(cè)膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞(Glioma Stem Cells/Progenitors,GSCPs)源于神經(jīng)干/祖細(xì)胞(Neural Stem Cells/ProgeIutors,NSCPs),但缺少實(shí)驗(yàn)根據(jù)??寺∫呀?jīng)發(fā)生膠質(zhì)瘤的基因工程鼠的GSCPs和NSCPs以及同品系胎鼠的NSCPs,旨在為進(jìn)一步研究兩者淵源關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。 方法
9、:取Tet—On小鼠位于小腦和大腦交界區(qū)域內(nèi)的腫瘤組織和位于遠(yuǎn)離腫瘤的側(cè)腦室室管膜下及其周圍盼正常腦組織,分別制成單細(xì)胞懸液,分別培養(yǎng)于無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu),流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hoechst33342陰性的SP細(xì)胞、細(xì)胞周期和染色體倍體,免疫熒光檢測(cè)球體及其分化細(xì)胞中的標(biāo)志物表達(dá)情況。 結(jié)果:源于Tet—On鼠的腫瘤組織和室管膜區(qū)正常組織以及胎鼠腦組織細(xì)胞,在無血清培養(yǎng)基條件
10、下,呈懸浮的球體狀生長,并且表達(dá)Nstin;在含血清的培養(yǎng)條件下,貼壁分化成能表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志蛋白的細(xì)胞。細(xì)胞球體在體外已傳代。電鏡結(jié)果顯示,GSCPs球體細(xì)胞具有核質(zhì)比高、細(xì)胞器不發(fā)達(dá)的幼稚細(xì)胞特征。GSCPs球體中SP細(xì)胞比例為17.27%,NSCPs球體中SP細(xì)胞比例為2.48%,GSCPs球體中異倍體細(xì)胞比例為26,77%,NSCPs球體中異倍體細(xì)胞比例為0%。 結(jié)論:分別在Tet—On膠質(zhì)瘤模型鼠中克隆到的GS
11、CPs和室管膜區(qū)域的NSCPs,都能在體外連續(xù)傳代培養(yǎng),為進(jìn)一步研究兩者的細(xì)胞分子生物學(xué)關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 第四部分、膠質(zhì)瘤千/祖細(xì)胞的分子信息分析 目的:已知膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞(Glioma Stem Cells/Progenitors,GSCPs)與神經(jīng)干/祖細(xì)胞(Neural Stem Cells/ProgeIutors,NSCPs)在分子信號(hào)傳遞通路開通和關(guān)閉時(shí)程調(diào)控上存在差異,而這種差異有可能就是NSCPs突變成G
12、SCPs的分子原因。通過基因表達(dá)譜分析,篩選其差異分子,為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子病因奠定基礎(chǔ)。 方法:取Tet—On膠質(zhì)瘤模型鼠的腫瘤組織中克隆到的GSCPs和室管膜區(qū)域的NSCPs以及來自于胎鼠胎腦的NSCPs,常規(guī)抽提和純化RNA,用Affymetrix Mouse Expression Array4302.0基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)三種細(xì)胞的基因表達(dá)譜改變,進(jìn)行兩兩對(duì)比篩選出上調(diào)2倍及以上的基因和下調(diào)2倍及以上的基因得到
13、三組數(shù)據(jù)。將初篩得到的三組差異表達(dá)基因分別進(jìn)行cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway的分析。 結(jié)果:通過對(duì)三種細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行兩兩比較,經(jīng)初步篩選后上調(diào)2倍及以上的基因分別有3423條、1014條和2441條;下調(diào)2倍及以上的基因分別有2524條、2546條、4266條。cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway分析結(jié)果顯示cell—cycle pathway在三組數(shù)據(jù)中都
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