腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是一種惡性程度高并且預(yù)后差的腦部腫瘤，占腦部全部腫瘤的50％以上。目前腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是最大程度的切除腫瘤，然后經(jīng)過放射治療，同時(shí)輔以替莫唑胺化療，這樣可以顯著地增加患者的生存期，但是仍有多于90％的患者復(fù)發(fā)，并且表現(xiàn)出強(qiáng)烈的放化療抵抗。為了更好地了解腦膠質(zhì)瘤放療抵抗的分子機(jī)制，我們按照臨床放療標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G單克隆進(jìn)行g(shù)amma射線照射總劑量60Gy后挑選8個(gè)放療抵抗單克隆，采用表達(dá)譜芯片和拷貝數(shù)變異芯片分別檢

2、測照射前后差異表達(dá)的基因和CNV片段，比較不同單克隆間差異表達(dá)的基因和CNV片段，并結(jié)合兩種芯片的結(jié)果篩選候選基因進(jìn)行易感性和功能研究。
　　兩種芯片的結(jié)果都表現(xiàn)出8個(gè)單克隆中差異表達(dá)的基因或者CNV片段既有相同的部分，又有各自特異的方面。表達(dá)譜結(jié)果中差異表達(dá)的基因數(shù)目最多的單克隆中有3473個(gè)差異基因，最少的有168個(gè)。CNV芯片的結(jié)果中差異CNV片段最多的單克隆中有380個(gè)，最少的有235個(gè)。分別統(tǒng)計(jì)兩種芯片中差異基因的數(shù)目及

3、出現(xiàn)頻率，表達(dá)譜數(shù)據(jù)中總共有4303個(gè)差異表達(dá)的基因，其中有199個(gè)與TCGA數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的跟生存期相關(guān)的基因一致，這些差異的基因在5個(gè)以上單克隆中出現(xiàn)的共有4個(gè)基因，分別為S100A4、BMP2、LGALS3和NNMT。CNV數(shù)據(jù)中差異CNV區(qū)域包含的基因共有14215個(gè)，其中含有最多數(shù)目的單克隆中有7274個(gè)基因，最少的單克隆中有3103個(gè)基因。兩種芯片中共同存在的差異基因共有1243個(gè)，其中在6個(gè)單克隆中都出現(xiàn)的有兩個(gè)基因(ATP

4、6V1D和SAT1)，在5個(gè)單克隆中出現(xiàn)的基因有4個(gè)，在5個(gè)單克隆中出現(xiàn)的基因有13個(gè)。
　　表達(dá)譜數(shù)據(jù)中熱圖的結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞8個(gè)單克隆可以分為2個(gè)大支。GO分析分別統(tǒng)計(jì)了每個(gè)單克隆中差異最顯著的前30個(gè)項(xiàng)目，其中在多個(gè)克隆中都富集到的項(xiàng)目有溶酶體、ECM與受體相互作用、細(xì)胞黏附、Wnt通路、TGF-β通路、乏氧與p53、氨酰-tRNA合成以及谷胱甘肽代謝等，通路分析的結(jié)果與GO分析的結(jié)果一致。
　　CNV芯片的LO

5、H結(jié)果顯示，T98G細(xì)胞總共有23個(gè)LOH區(qū)域，片段大小從3M到108.9M不等，A549細(xì)胞總共有21個(gè)LOH區(qū)域，片段大小從4.2M到95.6M不等。兩者共有9個(gè)CNV區(qū)域相同。與T98G細(xì)胞相比，不同單克隆中差異的LOH區(qū)域的數(shù)目也各不相同，其中相同的片段主要集中在1、7、8和16號(hào)染色體。單親二倍體(UPD)的分析中，我們發(fā)現(xiàn)T98G對(duì)照細(xì)胞在9號(hào)和17號(hào)染色體存在UPD，但是放射前后沒有變化，而A549細(xì)胞沒有檢測到UPD的存

6、在。
　　基于表達(dá)譜芯片和CNV芯片的結(jié)果，我們篩選出LGALS3基因作為功能研究的候選基因。LGALS3基因在5個(gè)單克隆中表達(dá)上調(diào)，并且在5個(gè)單克隆中拷貝數(shù)增加，兩種芯片中有3個(gè)單克隆中既表達(dá)上調(diào)，同時(shí)又存在拷貝數(shù)增加，而且LGALS3的表達(dá)量還跟生存期相關(guān)，因此被選為候選基因，進(jìn)行功能研究，由于輻射是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，因此我們同時(shí)研究LGALS3基因的遺傳多態(tài)性與腦膠質(zhì)瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。
　　LGAL

7、S3基因是半乳糖凝集素家族的一員，在細(xì)胞間、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核內(nèi)都有表達(dá)，參與了細(xì)胞不同的生物功能，如增殖、細(xì)胞黏附、血管生成和凋亡等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，但是在腦膠質(zhì)瘤的研究不多。
　　為了研究LGALS3基因遺傳多態(tài)是否跟腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，我們在華東地區(qū)收集了961例經(jīng)神經(jīng)病理診斷為膠質(zhì)瘤的病人和1351例的健康對(duì)照人群，對(duì)LGALS3基因的5個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，探討LGALS3基因的遺傳多態(tài)性

8、對(duì)腦膠質(zhì)瘤患病風(fēng)險(xiǎn)的影響。
　　單位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，rs4644位點(diǎn)的突變純合型AA對(duì)比于野生型CC可以顯著的增加腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后的OR=2.15，95％ CI=1.25-3.72，P=0.006。在隱性模型中，AA基因型對(duì)比于CC+CA基因型可以顯著的增加腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后的OR=2.10，95％ CI=1.22-3.62，P=0.007。rs4652位點(diǎn)突變純合型CC與野生型AA相比能夠增加腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，校

9、正后的OR=1.29，95％ CI=1.00-1.67，但是P值處于臨界狀態(tài)0.054。分層分析中，rs4644位點(diǎn)的AA基因型在男性和GBM中都可以顯著的提高腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后的OR值分別為2.07和2.81，95％CI分別為1.04-4.12和1.46-5.38。rs4652位點(diǎn)的CC基因型在女性和GBM中顯著的增加患病風(fēng)險(xiǎn)，校正后的OR值分別為1.56和1.44，95％ CI分別為1.03-2.37和1.01-2.06。以

10、上結(jié)果顯示，LGALS3基因的兩個(gè)錯(cuò)義突變的功能位點(diǎn)與中國人群腦膠質(zhì)瘤遺傳易感性相關(guān)。
　　根據(jù)易感性研究的結(jié)果，我們分別構(gòu)建了LGALS3基因中兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs4644-rs465的A-C和C-A兩種基因型的慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建了干擾質(zhì)粒，研究LGALS3基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、化療敏感性、遷移以及周期的變化。
　　結(jié)果顯示，過表達(dá)和干擾LGALS3基因可以明顯的改變T98G細(xì)胞的形態(tài)，使細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)長型。從增殖實(shí)驗(yàn)

11、的結(jié)果中可以看出，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)AC和CA基因型可以明顯的提高細(xì)胞的增殖能力，但是干擾組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比沒有顯著的差異。在不同的細(xì)胞株中加入化療藥替莫唑胺后，AC基因型的細(xì)胞的生存率明顯高于其他組，這與克隆形成率的結(jié)果一致。CA基因型的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞沒有明顯的差異，干擾組細(xì)胞的存活率明顯的低于組別。細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)AC和CA的細(xì)胞的遷移速度明顯的快于對(duì)照組和干擾組，干擾組細(xì)胞幾乎沒有發(fā)生遷移。細(xì)胞周期檢測的結(jié)果發(fā)

12、現(xiàn)，過表達(dá)和干擾LGALS3基因都會(huì)使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G的S期和G2期細(xì)胞比例增多，G1期細(xì)胞比例減少。
　　本研究主要采用表達(dá)譜芯片和CNV芯片分別從RNA和DNA水平上探討了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制，篩選出了與放療抵抗相關(guān)的基因和CNV片段，并選取了其中的LGALS3基因進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)LGALS3基因與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，并且在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及化療抵抗等具有重要的作用，表明LGALS3基因在腦膠