RECK基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的研究.pdf

1、腫瘤是一類(lèi)常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的體細(xì)胞遺傳病，其發(fā)生率和死亡率均呈逐年上升的趨勢(shì)，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類(lèi)致死的第一或第二位病因。通過(guò)對(duì)腫瘤的家系分析、流行病學(xué)以及大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明了腫瘤是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用導(dǎo)致的一類(lèi)多基因參與的疾病。目前研究的結(jié)果以表明腫瘤是細(xì)胞中多種基因突變累積的結(jié)果。目前大量的努力致力于了解人類(lèi)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。一些分子包括粘附分子、金屬蛋白酶和血管粘性分子被認(rèn)為在侵襲和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用。R

2、ECK基因于1998年被日本京都大學(xué)分子腫瘤研究室通過(guò)cDNA表達(dá)克隆的方法從v-ki-ras轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞系中表達(dá)誘導(dǎo)扁平形態(tài)的基因中分離出來(lái)。 膠質(zhì)瘤是一種最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，統(tǒng)計(jì)資料表明其發(fā)生率占全部顱內(nèi)腫瘤的40％。雖然手術(shù)切除腫瘤，放療，化療治療膠質(zhì)瘤均取得了較好的效果，然而惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后中位生存期僅為14周，其術(shù)后一年生存率也不足50％，而2年生存率則低于10％。目前，判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后尚無(wú)有效的診斷方法。我們通

3、過(guò)用RT-PCR的方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)良性腫瘤組織中RECK、MMP-9和MMP-2的表達(dá)情況，以及免疫組化的方法檢測(cè)了膠質(zhì)瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)良性腫瘤組織中RECK蛋白的表達(dá)情況，探討RECK這一腫瘤抑制基因在此類(lèi)腫瘤進(jìn)展中所起的作用，以及與患者預(yù)后的關(guān)系,為研究顱內(nèi)惡性腫瘤的基因診斷和基因治療提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1．標(biāo)本來(lái)源：標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科2002年9月至2003年9月間，外科手術(shù)切

4、除新鮮膠質(zhì)瘤、顱內(nèi)良性腫瘤和正常腦組織標(biāo)本共73例。其中膠質(zhì)瘤58例、腦膜瘤6例、聽(tīng)神經(jīng)鞘瘤4例、垂體瘤2例、正常腦組織3例?；颊甙?3例男性和30例女性。年齡跨度在30～69( ±SD，53.06±8.65)歲之間。所得標(biāo)本經(jīng)本院病理科組織學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)并凍存于-70℃?zhèn)溆谩?2．免疫組化：為確定RECK基因表達(dá)的細(xì)胞相關(guān)性，上述標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化分析。石蠟包埋，4μm切片，烤片5分鐘，0.3％H<,2>O<,2>溶于甲醇滅活內(nèi)源

5、性酶，蛋白封閉，血清30’孵育。用鼠抗hRECK單克隆抗體做一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗，用生物素標(biāo)記的二抗孵育45’，然后用Veetastain．ABC試劑盒抗生物素一生物素過(guò)氧化物酶方法染色。顏色反應(yīng)在含0.1％H<,2>O<,2>的0.03％3’-2氨基聯(lián)苯胺四氯化物溶液中進(jìn)行。蘇木素復(fù)染，封片。試劑盒中的陽(yáng)性片用于陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗用于陰性對(duì)照。 3．RNA提取和RT-PCR：取-70℃凍存腫瘤組織塊約1克，用異硫氰

6、酸胍/酚/氯仿抽提法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度法定量后，取5微克RNA用于RT－PCR。RT－PCR用Takara兩步法試劑盒。引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件：94℃40秒，61℃～58℃每一循環(huán)降低0.5℃35秒，72℃45秒，共30個(gè)循環(huán)，500bpβ-actin用于內(nèi)對(duì)照。1％瓊脂糖電泳，PCR產(chǎn)物與設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度相符，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。電泳圖像用電泳圖像采集系統(tǒng)掃描到計(jì)算機(jī)作進(jìn)一步分析。 4．基因表達(dá)半定量分析：利用Smart

7、 View電泳圖像分析軟件對(duì)各個(gè)基因的表達(dá)做半定量分析，如圖1所示每個(gè)樣品在電泳后均有2條帶，假設(shè)β-aetin在各個(gè)樣品中的表達(dá)水平相同，并設(shè)定為1，然后以這個(gè)表達(dá)水平為參照，檢測(cè)相應(yīng)的基因表達(dá)水平，結(jié)果為相對(duì)定量值，以數(shù)字表示，用于統(tǒng)計(jì)分析。 5．相關(guān)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：生存時(shí)間的計(jì)算從手術(shù)日期至死亡日期，或隨訪日期?；颊叩呐R床和組織病理學(xué)特征與RECK蛋白表達(dá)相關(guān)關(guān)系比較用x2檢驗(yàn)；各類(lèi)腫瘤的RECK、MMP-9、MMP-2

8、mRNA基因表達(dá)水平相關(guān)關(guān)系比較用SNK統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS11.5。P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1．PCR擴(kuò)增得到的RECK、MMP-2、MMP-9基因的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為227bp、212bp、152bp。 2．RECK在腦膠質(zhì)瘤及良性腦腫瘤中的表達(dá)：在58例腦膠質(zhì)瘤患者中有19例RECK表達(dá)相對(duì)定量值>0.50，按照’WHO分級(jí)I～Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ-Ⅳ級(jí)2例。其余39例RECK表達(dá)相對(duì)定量值均<0.50，其中32例為

9、Ⅲ-Ⅳ級(jí)患者，7例為I～Ⅱ級(jí)患者。12例良性腦腫瘤和3例正常腦組織RECK表達(dá)相對(duì)定量值均>0.50。 3．RECK、MMP-2及MMP-9mRNA水平表達(dá)情況及相關(guān)關(guān)系：各病理級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤、良性腦腫瘤及正常腦組織的3種基因表達(dá)水平經(jīng)量化后可知RECK表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．經(jīng)免疫組化分析，以試劑盒中所帶陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞中出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒者定為RECK表達(dá)陽(yáng)性，不

10、著色或著色淺而不特異者為RECK表達(dá)陰性。RECK蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)。 5．RECK蛋白表達(dá)與腦腫瘤的相關(guān)關(guān)系：在70例腦腫瘤組織中，膠質(zhì)瘤組織切片僅有五例為陽(yáng)性表達(dá)，且表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中，其余65例均無(wú)明確的表達(dá)。而12例良性腫瘤和正常腦組織則均為陽(yáng)性表達(dá)。 RECK(逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的富含半胱氨酸，含有kazal 域的蛋白)基因通過(guò)cD-NA表達(dá)克隆的方法從v-ki-ras轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞系中表達(dá)誘導(dǎo)扁平形態(tài)的基因分

11、離出來(lái)。RECK基因編碼大約110KDa的跨膜蛋白，有多個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣的重復(fù)區(qū)和絲氨酸蛋白酶抑制物相似域。RECK基因普遍存在于各種正常組織和非腫瘤細(xì)胞系中，而在一些腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系和腫瘤基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中，其表達(dá)被抑制。當(dāng)恢復(fù)RECK基因表達(dá)則抑制了一些腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移或惡性表型，同時(shí)抑制這些細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、MMP-2。 很多研究致力于人類(lèi)腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性表型的分子機(jī)理。一些分子，包括粘附分子、金屬蛋白

12、酶和血管源性因子被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)移和惡性型的關(guān)系因素。膠質(zhì)瘤，占顱腦腫瘤的40-50％，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤。其預(yù)后極差。因此需要找到這個(gè)疾病有效的預(yù)后指標(biāo)。本研究中我們探討了惡性抑制基因RECK作為膠質(zhì)瘤預(yù)后指標(biāo)的潛在價(jià)值，以及相關(guān)的金屬蛋白酶MMP-9、MMP-2在腦膠質(zhì)瘤中的變化與RECK的相關(guān)關(guān)系。目前體內(nèi)和體外的研究證明膠質(zhì)瘤的侵襲性與金屬蛋白酶MMPs的表達(dá)和活化有密切的關(guān)系。RECK是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑制一些腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移

13、或惡性表型的重要基因，其作用主要是通過(guò)抑制金屬蛋白酶MMP--9和MMP-2實(shí)現(xiàn)的。 我們發(fā)現(xiàn)RECK在腦膠質(zhì)瘤中有一定程度的表達(dá)，與之后的肝細(xì)胞癌、大腸癌和的臨床研究結(jié)果一致。RECK高表達(dá)可能某種程度上與纖維損傷形成相關(guān)，因?yàn)镽ECK蛋白抑制基質(zhì)降解酶。RECK表達(dá)受細(xì)胞外激活控制，受Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制，并已知轉(zhuǎn)換很多生長(zhǎng)因子信號(hào)，同時(shí)被一個(gè)或多個(gè)尚不知的血清因子激活。這樣，腫瘤本身可能通過(guò)產(chǎn)生這樣的可溶性因子影響周?chē)M織

14、RECK表達(dá)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)RECK表達(dá)與腦腫瘤的惡性度有著密切的關(guān)系。這一結(jié)果與先前實(shí)驗(yàn)在腫瘤細(xì)胞系中恢復(fù)RECK基因表達(dá)可使其侵襲及惡性度降低的結(jié)果吻合。這就說(shuō)明RECK表達(dá)在抑制腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)程中起到很重要的作用，即延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。 雖然RECK抑制腫瘤侵襲的詳細(xì)機(jī)理目前還在研究中，但在RECK表達(dá)細(xì)胞中抑制金屬蛋白酶的分泌直接參與了這一過(guò)程是肯定的。但在我們的研究中RECK與MMP-9的表達(dá)相似，MMP-2的表達(dá)在膠

15、質(zhì)瘤中也僅有輕微的上升。有研究指出RECK基因啟動(dòng)子區(qū)域的SP1結(jié)合部位對(duì)于該基因表達(dá)非常重要。有趣的是，另有一些研究證實(shí)SP1是MMP-9基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄上調(diào)的必要元素之一。因此，SP1轉(zhuǎn)錄因子家族的存在可能是造成RECK和MMP-9 mRNA表達(dá)相似的原因。RECK缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死亡，而缺少TIMP1或TIMP2對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響力不大。這就說(shuō)明在胚胎發(fā)育過(guò)程RECK比TIMPs更具影響力。在將來(lái)的研究中，探討這兩組MMPs調(diào)節(jié)物在腫