miR-92a在腦膠質(zhì)瘤和腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤之一，惡性水平高，具有很高的發(fā)病率與死亡率。近年來，雖然人們在腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)醫(yī)治以及術(shù)后放療、化療等方面取得了長足的進(jìn)步，但是惡性腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后依然很差，確診后的平均生存周期不超過15個月。最新的研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在一小部分具備干細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群，這類細(xì)胞可以持續(xù)增殖，具備自我更新能力和多向分化潛能，被定義為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stem cells，GSCs)。GSCs細(xì)

2、胞的存在是腦膠質(zhì)瘤形成、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及放化療耐受的主要原因。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類在進(jìn)化上高度保守，長度大約在22nt左右的非編碼RNA分子，可以通過直接作用于下游mRNAs的3'端非翻譯區(qū)(3'Untranslated Regions，3'UTR)阻止mRNAs的轉(zhuǎn)錄，和/或誘導(dǎo)mRNAs的降解，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)體內(nèi)基因的表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs分子能夠起著類似于原癌基因或者抑癌

3、基因的作用，影響腫瘤細(xì)胞的形成與發(fā)展。此外，也有文獻(xiàn)報道指出miRNAs在腫瘤干細(xì)胞分化和自我更新的調(diào)控中也發(fā)揮著重要的功能。因此，可以通過改變miRNAs的表達(dá)量來降低腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的惡性程度，這可能是一個很有前景的治療方案。
　　在本研究中，作者通過高通量測序技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)，與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，GSCs細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平顯著降低。之前的文獻(xiàn)報道表明，miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和腦膠質(zhì)瘤病人的組織標(biāo)本中高表達(dá)

4、，降低miR-92a的表達(dá)水平可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲以及GSCs細(xì)胞生存、遷移和自我更新中的功能尚不明確。所以，充分了解miR-92a在這兩種細(xì)胞中的功能和具體分子機(jī)制，可以為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。
　　研究目的：
　　探索miR-92a在腦膠質(zhì)瘤以及GSCs細(xì)胞中的功能和詳細(xì)作用機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　

5、　1.采用無血清饑餓培養(yǎng)法從腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87和U251）中分離培養(yǎng)出GSCs細(xì)胞，并用免疫熒光染色法鑒定GSCs細(xì)胞;
　　2.采用第二代高通量測序技術(shù)比較U87細(xì)胞和來源于U87的GSCs細(xì)胞U87s中miRNAs的表達(dá)量差異;
　　3.采用MTT、細(xì)胞劃痕、Transwell以及AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測miR-92a對U87和U251細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響;
　　4.采用裸鼠成瘤

6、實(shí)驗(yàn)檢測miR-92a在體內(nèi)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響;
　　5.采用qPCR、Western Blot和腫瘤干細(xì)胞球成球等實(shí)驗(yàn)檢測miR-92a對GSCs細(xì)胞生長、遷移以及自我更新的影響;
　　6.結(jié)合生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)預(yù)測并鑒定miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs細(xì)胞中的靶基因;
　　7.采用Western Blot和免疫熒光染色法確定miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs細(xì)胞中作用的分子機(jī)制。

7、r>　　研究結(jié)果：
　　1.利用無血清饑餓培養(yǎng)法從腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87和U251)中分離出GSCs細(xì)胞(U87s和U251s)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSCs細(xì)胞表面表達(dá)腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志CD133和神經(jīng)干細(xì)胞的分子標(biāo)志Nestin，分化后的GSCs細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)志GFAP以及神經(jīng)元細(xì)胞的分子標(biāo)志β-tubulinⅢ;
　　2.高通量測序的分析結(jié)果顯示共有94個miRNAs在U87細(xì)胞和U87s細(xì)胞間差異

8、表達(dá)，其中miR-92a在U87s細(xì)胞中顯著低表達(dá)。qPCR鑒定結(jié)果表明miR-92a在U87s細(xì)胞和U251s細(xì)胞中均顯著下調(diào);
　　3.下調(diào)miR-92a的表達(dá)量在體外可以有效的降低U87細(xì)胞和U251細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡;
　　4.降低miR-92a的表達(dá)水平可以有效的抑制腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長;
　　5.在GSCs細(xì)胞中上調(diào)miR-92a的表達(dá)量后，腫瘤干細(xì)胞球直徑變小、細(xì)胞遷移能力減

9、弱、腫瘤干細(xì)胞球形成率降低，細(xì)胞干性維持相關(guān)分子標(biāo)志表達(dá)量下調(diào);
　　6.生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果表明miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs細(xì)胞中可作用于不同的靶基因，miR-92a在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的靶基因?yàn)镃DH1，在GSCs細(xì)胞中的靶基因則為Notch-1;
　　7.腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)量下調(diào)后，CDH1蛋白量增多，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin含量減少，而總的β-catenin含量不變;

10、　　8.在GSCs細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-92a后，Notch-1蛋白下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt的含量減少，而總的Akt含量不變;
　　9.過表達(dá)CDH1可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，而降低Notch-1的表達(dá)則可抑制GSCs細(xì)胞的生長、遷移和自我更新能力。
　　研究結(jié)論：
　　本研究首先從腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離出GSCs細(xì)胞，通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-92a在兩種類型的細(xì)胞中差異表達(dá)。qPCR結(jié)果證實(shí)，與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比

11、，GSCs細(xì)胞內(nèi)miR-92a的含量明顯降低。降低miR-92a的表達(dá)水平可有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;miR-92a含量減少后，腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤生長速度也明顯減慢。另一方面，上調(diào)miR-92a的含量可以顯著抑制GSCs細(xì)胞的生長，遷移和自我更新。深入的機(jī)制研究表明，miR-92a可以通過分別作用于下游CDH1/β-catenin和Notch-1/Akt信號通路，影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和GSCs細(xì)胞的惡性表