腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞作用機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景和目的:
　　 膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，病死率高，嚴(yán)重威脅人類健康。膠質(zhì)瘤的治療方法主要為手術(shù)后輔以放療和化療等綜合治療，但總體預(yù)后仍不理想，5年生存率低。據(jù)統(tǒng)計，惡性腦腫瘤占人類所有癌癥患者的2％，占兒童全身腫瘤發(fā)病率的20％～25％，綜合發(fā)病年齡高峰在30～40歲，或10～20歲。其中又以膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)病率最高，約占惡性腦腫瘤40.49％。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者從確診開始的中間生存時間是15個月，由于膠質(zhì)細(xì)胞

2、瘤分化不全、且深入神經(jīng)細(xì)胞深處，常規(guī)的抗腫瘤措施，包括手術(shù)、放療和化療都很難有效根除，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率較高。這與膠質(zhì)瘤本身的生物學(xué)特性密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織之間無明顯界限，手術(shù)難以做到將腫瘤全切除，而血腦屏障的存在以及膠質(zhì)瘤對大部分細(xì)胞毒性藥物的高度耐藥使得傳統(tǒng)化療作用也非常有限。盡管顯微手術(shù)技術(shù)有了很大的進(jìn)步，手術(shù)的安全切除范圍也得到進(jìn)一步擴(kuò)大，相關(guān)并發(fā)癥有了明顯的下降，術(shù)后放療的常規(guī)應(yīng)用以及新一代的口服化療藥如替

3、莫唑胺的普及在一定程度上提高了患者術(shù)后生存期。但這些技術(shù)上的進(jìn)步對于惡性膠質(zhì)瘤患者的總體預(yù)后并無非常明顯的改善，其最大難點(diǎn)仍在于復(fù)發(fā)。有鑒于此，惡性膠質(zhì)瘤的治療和控制一直是神經(jīng)外科臨床和科研工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)內(nèi)容之一，對于其新的輔助治療方法的探索，以期有效抑制或延緩腫瘤復(fù)發(fā)具有重要的科學(xué)和社會意義。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤中存在一種數(shù)量極少具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，正是這類細(xì)胞導(dǎo)致膠質(zhì)瘤產(chǎn)生和復(fù)發(fā)，這類細(xì)胞已經(jīng)被定義為腦腫瘤干細(xì)

4、胞(braintumorstemcells，BTSCs)。BTSCs存在于惡性腦膠質(zhì)瘤的事實(shí)最早由Ignatova等（2002年）報道，他們將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有克隆形成，其細(xì)胞表達(dá)NSCs標(biāo)志物Nestin，分化細(xì)胞則同時或單獨(dú)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronespecificenolase，NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(glialfibrILl

5、aryacidicprotein，GFAP)和神經(jīng)元β-Ⅲ微管蛋白(neuronalbeta—Ⅲtubulin)等并有基因轉(zhuǎn)錄，提示這類細(xì)胞具有NSCs特性，具有分化為神經(jīng)元樣和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的能力，因而把這類細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(tumorstem-likecells)，并認(rèn)為其與腫瘤起源和生長有關(guān)。此后，又有Singh等（2004年）發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中幾乎所有的細(xì)胞增殖均由一小部分表達(dá)人類干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的細(xì)胞即BTSCs產(chǎn)生

6、。在培養(yǎng)基中，這些細(xì)胞可以增殖并分化為神經(jīng)元和（或）膠質(zhì)細(xì)胞，比例、表型與原腫瘤一致。這些新生的腫瘤細(xì)胞又可以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，證明它們是腫瘤細(xì)胞而不是被腫瘤樣本污染的正常NSCs。Hemmati等（2003年）對小兒髓母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)存在與NSCs性質(zhì)相似的細(xì)胞，它們在體外可形成神經(jīng)球，能夠自我更新，且具有多分化潛能，在一定環(huán)境中可分化成具有神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞，細(xì)胞比例與原腫瘤相似，提示其參與

7、了腦腫瘤的形成:與正常NSCs不同的是，這些細(xì)胞在異體原位移植后，可以分化為與原腫瘤相似表型和核型的腫瘤。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryT-cells，Treg細(xì)胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一群通過細(xì)胞間接觸并產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，1995年由Sakaguchi首次報道。Treg細(xì)胞具有低反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能，對維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。Treg細(xì)胞在抑制效應(yīng)性T細(xì)胞

8、功能的同時、也降低機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程中扮演重要角色。在多種惡性腫瘤組織中（如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，惡性淋巴瘤等）都有大量Treg細(xì)胞浸潤，其在患者外周血淋巴細(xì)胞中的比例也明顯升高。并且，Treg細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤的發(fā)展呈正相關(guān)、而與腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因此，清除Treg細(xì)胞或抑制Treg細(xì)胞功能將有助于機(jī)體抗腫瘤免疫功能的恢復(fù)。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/win

9、gedhelixtranscriptionfactor,FOXP3)在Treg細(xì)胞上特異性表達(dá)，是控制Treg發(fā)育及其功能效應(yīng)的關(guān)鍵基因。
　　 Th17細(xì)胞則是輔助性T細(xì)胞亞群的新成員。Th17細(xì)胞最初被發(fā)現(xiàn)于自身免疫性疾病，它們表達(dá)CD4和IL-17。初始CD4+T細(xì)胞可在TGF-β和IL-6影響下，依賴轉(zhuǎn)錄因子RORγt而分化為Th17細(xì)胞，IL-23，IL-1β等細(xì)胞因子也被認(rèn)為與該亞群細(xì)胞分化及功能有關(guān)。研究還表明，T

10、h17細(xì)胞在感染和自身免疫性疾病中，主要通過表達(dá)IL-17及誘導(dǎo)趨化因而誘發(fā)感染和持續(xù)炎癥等病理過程:同時，該群細(xì)胞還具有促腫瘤生長的生物學(xué)作用，目前已知Th17細(xì)胞主要經(jīng)其效應(yīng)分子IL-17通過以下幾種方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展:(1)上調(diào)VEGF、CD31等因子表達(dá)，從而促進(jìn)血管增生，加速腫瘤生長;(2)上調(diào)IL-6、STAT3信號途徑，并由此促進(jìn)腫瘤進(jìn)展;(3)下調(diào)Th1表面IL-12Rβ分子表達(dá)，從而下調(diào)Th1細(xì)胞功能、抵抗有效腫瘤

11、免疫;(4)使CD8+細(xì)胞共表達(dá)IL-17，從而使CD8+細(xì)胞失去細(xì)胞毒效應(yīng)，發(fā)揮抗凋亡作用。
　　 由此可知，BTSCs與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)具有密不可分的關(guān)聯(lián)性，而Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞也通過相關(guān)免疫機(jī)制或炎性機(jī)制而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。那么，在Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間、BTSCs細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間、BTSCs細(xì)胞與Th17細(xì)胞之間等究竟存在著怎樣的關(guān)系？BTSCs是否通過Treg或Treg細(xì)胞而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤

12、免疫耐受？
　　 目前的研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)胞和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞之間，其功能和分化過程常呈相互對抗?fàn)顟B(tài)。機(jī)體處于正常狀態(tài)下，兩者可保持相對的平衡:一旦出現(xiàn)機(jī)體功能異常，則時常表現(xiàn)出Treg/Th17的功能與分化過程失衡。另有研究表明，由活化樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-6是決定初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞或是Th17細(xì)胞方向分化的關(guān)鍵因子。還有研究顯示，孤獨(dú)核受體RORγt（一種核激素受體超家族成員）

13、是Th17細(xì)胞分化中主要的轉(zhuǎn)錄因子，而Foxp3作為Treg的重要標(biāo)志性分子，其全長亞型可與RORγt結(jié)合從而抑制RORγt的功能、減少RORγt對IL-17在Th17細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)抑制作用。
　　 已知Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在相同腫瘤中的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，表明在腫瘤微環(huán)境中，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞存在著相互作用。有報道稱，小鼠周圍神經(jīng)的成熟Treg細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，尤以感染和IL-6產(chǎn)生過程中容易發(fā)生該類現(xiàn)象。另有

14、報道指出，腫瘤相關(guān)Treg細(xì)胞表達(dá)高水平的CD39，后者是一種外核苷酸酶，可將ATP轉(zhuǎn)換為腺苷、從而通過腺苷通路抑制Th17細(xì)胞的激活。也有報道稱，小鼠Treg細(xì)胞可阻止Th17細(xì)胞反應(yīng)。如果Th17細(xì)胞介導(dǎo)免疫防御，那么，阻止Th17細(xì)胞發(fā)展可逃避免疫系統(tǒng)的防御反應(yīng)。
　　 目前國內(nèi)外關(guān)于膠質(zhì)瘤、Treg和Th17細(xì)胞三者之間的研究還很少，最近的一篇報道表明，膠質(zhì)瘤內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞均可以隨著時間的推移而增多，并且Th1

15、7細(xì)胞的極化可以通過Treg細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞因子作用完成，提示膠質(zhì)瘤組織內(nèi)的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞均有重要的免疫作用。
　　 既然Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞之間具有相互作用、并且通過相關(guān)免疫機(jī)制或炎性機(jī)制而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而BTSCs在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中又占有重要的源頭性作用地位（BTSCs通常被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤的啟動細(xì)胞），因此，本研究針對膠質(zhì)瘤中的BTSCs與同個體Treg或Th17細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。我

16、們通過同步分析膠質(zhì)瘤模型大鼠及膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源個體的BTSCs特點(diǎn)、這些BTSCs與同個體Treg細(xì)胞或Th17細(xì)胞特點(diǎn)的相關(guān)性，以及在它們并存與否情況下對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展、惡性度乃至個體生存期的影響等，試圖深入分析BTSCs在膠質(zhì)瘤相關(guān)免疫環(huán)境中所處的作用地位。
　　 二、方法:
　　 本研究分為三部分。
　　 第一部分:BTSCs分離純化及特性
　　 收集術(shù)中膠質(zhì)瘤標(biāo)本（分級按WHO標(biāo)準(zhǔn)），經(jīng)過剪切修整、

17、常規(guī)胰酶消化等步驟獲取游離的膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞，以DMEM/F12培養(yǎng)基加胎牛血清原代培養(yǎng)，至第3～5天取部分原代細(xì)胞、并以流式細(xì)胞儀檢測其中CD133陽性細(xì)胞的表達(dá)率。再通過無血清培養(yǎng)法(DMEM/F12培養(yǎng)基加B27、堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)連續(xù)分別培養(yǎng)人原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞和大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(9L)，經(jīng)10～20天左右培養(yǎng)出懸浮的腫瘤球（即BTSCs球），再經(jīng)免疫細(xì)胞染色和流式細(xì)

18、胞檢測等方法，驗(yàn)證這些腫瘤球表達(dá)CD133和Nestin表面標(biāo)志物的情況。CCK-8檢測這些細(xì)胞的生存情況。通過立體定向手術(shù)，將大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別移植到F344或Wistar大鼠腦內(nèi)或者皮下，觀察移植后大鼠的生存期和皮下腫瘤生長大小的情況。
　　 第二部分:BTSCs與Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子
　　 在第一部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)建原位膠質(zhì)瘤動物模型基礎(chǔ)上，以CD4+和CD4+FOXP3+淋巴細(xì)胞在外周血的表達(dá)率為評估指標(biāo)，用流式

19、細(xì)胞計數(shù)儀、檢測外周血中的Treg細(xì)胞含量，并通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測外周血細(xì)胞因子（如IL-10，IL-6，TGF-β，IFN-γ等）的表達(dá)情況。在建立模型后第17天，處死模型鼠，取出膠質(zhì)瘤組織，制備組織切片，利用免疫組化檢測腫瘤組織中Foxp3、CD133和Nestin的蛋白表達(dá):通過定量PCR的方法檢測腫瘤組織中Foxp3、CD133和Nestin的基因表達(dá)。收集人源膠質(zhì)瘤標(biāo)本、并抽取患者外周血，在熒光定量PCR檢測腫瘤組

20、織中Foxp3、CD133和Nestin基因表達(dá)的同時，同步以流式細(xì)胞計數(shù)儀對腦膠質(zhì)瘤患者外周血單個核細(xì)胞中CD4+Foxp3+細(xì)胞的含量進(jìn)行檢測、并評定外周血中Treg細(xì)胞的含量。
　　 第三部分:BTSCs與Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子
　　 在第一部分構(gòu)建原位膠質(zhì)瘤動物模型的基礎(chǔ)上，通過流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測模型鼠外周血中CD4+IL17+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的表達(dá)率，以驗(yàn)證Th17細(xì)胞的陽性率，并通過酶聯(lián)免疫法(ELIS

21、A)檢測外周血中的細(xì)胞因子（如IL-17和IL-23等與Th17相關(guān)的細(xì)胞因子）表達(dá)情況。在建立模型后第17天，處死模型鼠，取出膠質(zhì)瘤組織，制備組織切片，利用免疫組化檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的蛋白表達(dá):通過定量PCR檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的基因表達(dá)。收集人源膠質(zhì)瘤標(biāo)本，并抽取患者外周血，流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測外周血Th17細(xì)胞含量（以CD4+IL17+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的百分率為評估指

22、標(biāo)），同步以熒光定量PCR檢測腫瘤組織中IL-17、CD133和Nestin的基因表達(dá)。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)。計量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD或mean±SD)表示。生存周期采用Kaplan-Meier方法分析，Cox模型被用于分析膠質(zhì)瘤患者的病理分級、年齡和性別。單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組資料之間的比較采用單因素方差分

23、析，并用LSD法做多重比較，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、BTSCs
　　 我們成功地從原代膠質(zhì)瘤組織中以及9L細(xì)胞系中分離出腫瘤細(xì)胞球（即BTSCs球），這些BTSCs球均在無血清培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)形成。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測證明，這些腫瘤球均陽性表達(dá)CD133和Nestin等BTSCs的標(biāo)記蛋白（圖1-2）;將這些腫瘤球放入普通血清培養(yǎng)環(huán)境后，腫瘤球貼壁生長，且主要表達(dá)GFAP或NS

24、E蛋白（圖1-3）。將普通的大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞和能形成腫瘤球的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別植入大鼠腦內(nèi)后，觀察發(fā)現(xiàn)，種植腫瘤球的大鼠中位生存時間（22.00±0.557天）要比種植普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞的大鼠中位生存時間（27.00±2.309天）短（圖1-6）。同時發(fā)現(xiàn)，種植普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞的大鼠的神經(jīng)癥狀如癲癇發(fā)作、偏癱等發(fā)生也較晚。皮下種植膠質(zhì)瘤的大鼠，在種植后第21天處死，取出腫瘤，經(jīng)測量體積、統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，用腫瘤球種植的大鼠，最后腫瘤的平均體積都較大（

25、平均1665.50±184.304mm3）:而用普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植的相對較小(平均1218.75±106.456mm3)（圖1-6，表1-4）。對人源膠質(zhì)瘤標(biāo)本形成腫瘤球的情況、和患者生存時間同步平行分析后發(fā)現(xiàn)，能在體外培養(yǎng)過程中形成腫瘤球的患者，其生存期較短（圖1-4，表1-2，1-3）。
　　 2、BTSCs和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子
　　 針對動物標(biāo)本:ELISA檢測顯示，外周血的IL-10和TGF-β在原位膠

26、質(zhì)瘤大鼠模型中，相比正常健康對照大鼠，均有顯著差異(圖2-2，2-3)。同時，在外周血TGF-β的表達(dá)方面，以普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞制備的大鼠模型與由腫瘤球制備的大鼠模型相比，有顯著差異。流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，正常大鼠的外周血CD4+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量(6.24±1.832％)，與原位膠質(zhì)瘤模型鼠的該類細(xì)胞數(shù)量(9.82±2.663％)相比有顯著差異。移植普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞的模型鼠與移植腫瘤球的模型鼠相比，外周血CD4+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量(8

27、.12±2.493％vs.11.52±2.663％)也有顯著差異（圖2-1）。免疫組化檢測表明，在模型鼠腫瘤組織中均有CD4+Foxp3+細(xì)胞的存在(圖2-4，2-6)。
　　 針對人源標(biāo)本:流式細(xì)胞檢測顯示，與正常成人對照相比、膠質(zhì)瘤患者外周血中CD4+Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量增高(4.640±0.817％vs8.713±2.178％)，二者之間有顯著差異（圖2-8）。定量PCR檢測證實(shí)，人膠質(zhì)瘤組織中存在CD4+Foxp3+細(xì)

28、胞，并且膠質(zhì)瘤組織中Foxp3的表達(dá)顯著高于對照組:同時CD133和Nestin的表達(dá)，膠質(zhì)瘤組也顯著高于對照組（圖2-9，2-10）。
　　 3、BTSCs和Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子
　　 針對動物標(biāo)本:ELISA檢測顯示，外周血的IL-17和IL-23在原位膠質(zhì)瘤大鼠模型中，相比正常健康對照大鼠，無顯著差異（圖3-2，3-3）。流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，正常大鼠外周血中CD4+IL-17+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞亞群中的

29、數(shù)量，與原位膠質(zhì)瘤模型鼠相比無顯著差異（圖3-1）。免疫組化檢測結(jié)果表明，在模型鼠腫瘤組織中均有CD4+IL-17+細(xì)胞的存在（圖3-4）。定量PCR也證實(shí)了膠質(zhì)瘤組織中有IL-17的表達(dá)。
　　 針對人源標(biāo)本:流式細(xì)胞檢測顯示，與正常成人對照相比、膠質(zhì)瘤患者外周血中CD4+IL-17+細(xì)胞的數(shù)量無顯著差異（圖2-8）。定量PCR檢測結(jié)果顯示，人膠質(zhì)瘤組織中有IL-17的表達(dá)，但是與對照組相比兩者差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2-9，

30、2-10)。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、與腫瘤球（BTSCs球）陰性的個體相比，腫瘤球（BTSCs球）陽性的荷膠質(zhì)瘤大鼠及膠質(zhì)瘤患者生存期明顯縮短。
　　 2、與腫瘤球(BTSCs球)陰性的個體相比，腫瘤球（BTSCs球）陽性的荷膠質(zhì)瘤大鼠及膠質(zhì)瘤病員外周圍血Treg細(xì)胞數(shù)量增多，且在隨著BTSCs增多而增多的同時、免疫耐受相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β也顯著升高。
　　 3、與腫瘤球（BTSCs球）陰性的個體