腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物體外敏感試驗(yàn)的研究.pdf

1、背景與目的:腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見的一型,占到顱內(nèi)腫瘤的35％~51％。近幾年來(lái),雖然顱內(nèi)腫瘤的診療手段不斷提高,同時(shí)腦膠質(zhì)瘤的分子、基因方面的研究也有了很大進(jìn)展,但對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療并沒(méi)有重大突破,患者的預(yù)后欠佳,惡性膠質(zhì)瘤患者大多數(shù)(約占77％)在確診后1年內(nèi)死亡。目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要方法仍是以手術(shù)治療、放射治療、藥物治療等組成的綜合治療體系。因此,如何立足于現(xiàn)有的治療技術(shù),提高顱內(nèi)腫瘤特別是腦膠質(zhì)瘤的治療效果,延長(zhǎng)病人生存時(shí)

2、間,提高病人的生活質(zhì)量就成為當(dāng)今神經(jīng)外科亟待解決的難題。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn):在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中,僅有一小部分腫瘤細(xì)胞(即腫瘤干細(xì)胞)具有廣泛的增殖和自我更新能力,而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞從發(fā)生起始,就逐步進(jìn)入分化、成熟甚至衰老階段,缺乏或是漸漸失去增殖及自我更新的能力,僅有腫瘤形態(tài)學(xué)上的外在表現(xiàn)。繼從白血病和乳腺癌中成功分離出具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞之后,腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存在也得以確證。腦膠質(zhì)瘤內(nèi)存在有性質(zhì)與神經(jīng)干細(xì)胞

3、相似的細(xì)胞,這些細(xì)胞在體外無(wú)血清培養(yǎng)基中可形成腫瘤球,具有自我更新、異常的增殖及多向分化潛能,且細(xì)胞比例與原腫瘤相似,可能參與了腦膠質(zhì)瘤的形成。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):該類細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)人類干細(xì)胞標(biāo)志物CD133,可從實(shí)體膠質(zhì)瘤中分離,即腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(braingiloma stem cell,BGSC)。將此類細(xì)胞以100個(gè)為量接種入NOD-SCID鼠腦,觀察3-6個(gè)月后,可見鼠腦內(nèi)長(zhǎng)出新生腫瘤,且表型與親代腫瘤相似。針對(duì)腦膠質(zhì)瘤

4、干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療,為人腦膠質(zhì)瘤的治療方法提出了新的思路?，F(xiàn)今治療顱內(nèi)腫瘤的常用手段是:在神經(jīng)安全的前提下最大范圍的切除腫瘤組織,并聯(lián)合術(shù)后有效的放化療。選擇合適的、敏感性高的化療藥物可有助提高手術(shù)和放療的效果,改善病人生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期。近年來(lái),個(gè)體化治療成為腫瘤治療的主導(dǎo)趨勢(shì),化療前進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)排除無(wú)效藥物,篩選敏感藥物,并根據(jù)患者具體情況制定個(gè)體化的化療方案,避免特異性不強(qiáng)的化療藥物給患者造成毒副作用,可最終達(dá)到提高臨床化療

5、效果并節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用的目的。結(jié)合上述學(xué)說(shuō)和臨床實(shí)際,進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在腦膠質(zhì)瘤中分離,培養(yǎng)及鑒定BGSC,選用替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸、順鉑四種化療藥物,對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)。替莫唑胺,一種治療腦膠質(zhì)瘤的新型口服化療藥物,是一種新型咪唑四嗪類,具有吸收完全,可通過(guò)血腦屏障,達(dá)血藥峰濃度較快等優(yōu)點(diǎn);雷帕霉素,一種療效好、低毒、無(wú)腎毒性的新型免疫抑制劑,主要用于治療白血病,近期發(fā)現(xiàn)還具有抗腫瘤的作用;亞砷酸,是我國(guó)傳統(tǒng)中藥砒

6、霜的主要成分,還未見有臨床治療腦膠質(zhì)瘤的報(bào)道;順鉑,是臨床一線化療藥物。通過(guò)觀察各種藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率變化情況,分析其對(duì)各藥物敏感程度,進(jìn)一步驗(yàn)證體外藥敏試驗(yàn)對(duì)膠質(zhì)瘤化療的指導(dǎo)意義,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　材料與方法:在無(wú)菌條件下,手術(shù)中切除并通過(guò)病理檢驗(yàn)證實(shí)的Ⅱ-Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤標(biāo)本,PBS充分沖洗后,經(jīng)膠原酶及胰酶消化為單細(xì)胞懸液,以2×10~5個(gè)/ml濃度接種于含有生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在相差倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情

7、況,并利用細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)Nestin和GFAP的表達(dá),細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)CD133的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。在鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞確為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后,分別將替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑以不同濃度[血藥峰濃度(μg/ml)ppc(plasma pleak concentration)](10ppc,5ppc,1.0ppc,0.5ppc,0.1ppc,0ppc),作用于體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,0ppc作為空白對(duì)照,用MTT法

8、檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化,采用Caspase-3免疫組化試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡,采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)抑制率進(jìn)行單因素的方差(One MayANOVA)分析,以檢驗(yàn)各藥物作用后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率間差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,利用最小顯著差法(LSD)進(jìn)行多重比較。
　　結(jié)果:腦膠質(zhì)瘤組織中確實(shí)存在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并能在體外分離、培養(yǎng);將單細(xì)胞懸液種植在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24~48h后可形成大小不一,折光性較強(qiáng)

9、,懸浮生長(zhǎng)的腫瘤干細(xì)胞球;培養(yǎng)4~5d后傳代,可形成次代腫瘤干細(xì)胞球,且數(shù)量增多,體積增大,形狀規(guī)則,腫瘤干細(xì)胞球和細(xì)胞形態(tài)與原代無(wú)異。免疫熒光化學(xué)染色CD133和免疫組織化學(xué)染色Nestin及GFAP陽(yáng)性表達(dá);用流式細(xì)胞儀對(duì)BGSC進(jìn)行細(xì)胞周期分析,證實(shí)其具有干細(xì)胞的典型周期特性,即大部分細(xì)胞處于G0/G1期,只有少數(shù)細(xì)胞處于S期。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外可進(jìn)行誘導(dǎo)分化,在倒置相差顯微鏡下觀察可見,細(xì)胞由周邊開始向外側(cè)分化生長(zhǎng),呈條梭狀,

10、形態(tài)似人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。不同濃度的替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸和順鉑對(duì)13例膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有其相應(yīng)的不同抑制率。替莫唑胺,1ppc時(shí),對(duì)BGSC作用72h和48h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為(64.3±1.7)％和(24.1±2.4)％,72h的細(xì)胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);雷帕霉素,1ppc時(shí),對(duì)BGSC作用72h和48h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為(37.8±0.4)％和(29.1±0.6)％,72h的細(xì)胞抑制率升高明

11、顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);亞砷酸,1ppc時(shí),對(duì)BGSC作用72h和48h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為(62.6±3.0)％和(40.5±2.2)％,72h的細(xì)胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);順鉑,1ppc時(shí),對(duì)BGSC作用72h和48h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率分別為(63.5±1.3)和(32.7±1.7)％,72h的細(xì)胞抑制率升高明顯,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),

12、替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸、順鉑四種化療藥物對(duì)BGSC增殖抑制率逐漸增高,呈時(shí)間-劑量效應(yīng)。當(dāng)藥物濃度均為為1ppc時(shí),作用24h后,亞砷酸對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)藥物濃度均為為1ppc時(shí),作用48h后,亞砷酸對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于替莫唑胺及雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

13、);當(dāng)藥物濃度均為為1ppc時(shí),作用72h后,替莫唑胺、亞砷酸及順鉑對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于雷帕霉素,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑對(duì)13例標(biāo)本中每1例的抑制率都不相同,且依據(jù)組織來(lái)源不同表現(xiàn)出個(gè)體化的差異。腫瘤干細(xì)胞經(jīng)替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑處理后,其形態(tài)發(fā)生改變,大量細(xì)胞從聚集的細(xì)胞團(tuán)周圍分離開,散在于培養(yǎng)基中,其折光性減弱。利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)Caspase-3在用藥后的細(xì)胞中的表

14、達(dá)情況,可見有陽(yáng)性表達(dá),提示凋亡過(guò)程中有Caspase-3酶原蛋白的激活。
　　結(jié)論:1.膠質(zhì)瘤組織中可以分離出表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、Nestin的腫瘤干細(xì)胞,并可在體外進(jìn)行培養(yǎng),具有自我更新和克隆增殖的能力。
　　2.替莫唑胺、雷帕霉素、亞砷酸及順鉑對(duì)不同來(lái)源的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有其相應(yīng)的抑制率。上述4種藥物對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞平均抑制率具有量-效與時(shí)-效關(guān)系,即隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞的抑制率增加。但不同藥