缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞逆分化的在體研究.pdf

1、背景及目的：
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，惡性程度與致死率最高的腫瘤為膠質(zhì)瘤。雖然已有手術(shù)切除、放療和化療的規(guī)范治療，但患者預(yù)后欠佳，腫瘤術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)腫瘤惡性程度更高，放化療更耐受。因此，亟需發(fā)展新的治療手段來改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。缺氧是實(shí)體瘤的一個(gè)重要特征，腫瘤干細(xì)胞的存在也已得到證實(shí)，且腫瘤干細(xì)胞處于缺氧微環(huán)境中。缺氧可以通過促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新來加重膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及放化療耐受。然而，對(duì)于分化期膠質(zhì)瘤

2、細(xì)胞是否同樣參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展并受缺氧微環(huán)境調(diào)控目前并未見明顯報(bào)道。為此，我們擬通過在體研究，證明缺氧可以誘導(dǎo)分化期膠質(zhì)瘤細(xì)胞逆分化形成膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞進(jìn)而加重膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展。
　　方法：
　　培養(yǎng)小鼠GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞，免疫磁珠分選出CD133-GL261細(xì)胞，部分細(xì)胞缺氧培養(yǎng)21天，另一部分細(xì)胞常氧培養(yǎng)21天。luc慢病毒感染上述條件處理后的CD133-GL261細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GL261-Luc細(xì)胞。將C57小鼠隨

3、機(jī)分為4組，組1小鼠用缺氧培養(yǎng)21天后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組2小鼠用常氧培養(yǎng)21天后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞行顱內(nèi)荷瘤（1×104/只），組1、組2小鼠均行常氧飼養(yǎng)(21％O2，5％CO2，74％N2)。于5d、10d、15d、20d、25d行活體成像，30天內(nèi)觀察生存率，行腫瘤標(biāo)本大體觀察及HE染色。組3、組4小鼠均用常氧培養(yǎng)21天后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞行顱內(nèi)荷瘤（5×104/只），組3小鼠行低氧飼養(yǎng)(10％O2，5％CO2，85％N2)，組4小鼠行常氧飼養(yǎng)(21％

4、O2，5％CO2，74％N2)。于5d、10d、15d、20d、25d行活體成像，30天內(nèi)觀察生存率，行腫瘤標(biāo)本大體觀察、HE染色，并用免疫組化、WB、RT-PCR檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX-2、OCT-4、KLF-4、Nanog、CD133表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、組1與組2活體成像比較:活體成像顯示組1小鼠在第10天開始有明顯腫瘤形成，25d后腫瘤體積進(jìn)一步增大，而組2小鼠顱內(nèi)無明顯成瘤，配對(duì)樣本T檢驗(yàn)得P＜0.0

5、01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、組3與組4活體成像比較:組3小鼠活體成像顯示隨著低氧飼養(yǎng)時(shí)間的延長，小鼠顱內(nèi)腫瘤體積逐漸增大，而組4顱內(nèi)成瘤不明顯，使用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)得P＜0.001。
　　3、生存期分析:30天觀察期內(nèi)組1小鼠生存率低于組2小鼠，組3小鼠生存率低于組4小鼠，P＜0.0001，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、大體標(biāo)本觀察:組1、組3小鼠顱內(nèi)有明顯腫瘤形成，HE染色證實(shí)。而組2、組4顱內(nèi)無明顯成瘤。

6、r>　　5、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè):
　　(1)免疫組化顯示組3腫瘤內(nèi)SOX-2、OCT-4、KLF-4、Nanog、CD133高表達(dá);
　　(2)RT-PCR檢測(cè)得正常C57小鼠、組3小鼠、組4小鼠的SOX-2、OCT-4、KLF-4、Nanog、 CD133的RNA表達(dá)量，組3小鼠高于其余兩組小鼠，單因素方差分析得P≤0.001，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而正常C57小鼠、組4小鼠差異P＞0.05，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　

7、(3)WB檢測(cè)顯示與正常C57小鼠、組4小鼠相比，組3小鼠腫瘤標(biāo)本SOX-2、OCT-4、KLF-4、Nanog、CD133蛋白表達(dá)高，單因素方差分析得P＜0.05，而正常C57小鼠與組4小鼠相較無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1、體外缺氧培養(yǎng)細(xì)胞小鼠顱內(nèi)荷瘤后有腫瘤形成且生存率較對(duì)照組明顯降低，提示體外缺氧培養(yǎng)可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞的形成。
　　2、體外常氧培養(yǎng)細(xì)胞顱內(nèi)荷瘤后小鼠行低氧飼養(yǎng)顱內(nèi)可以成瘤，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物