PPAR-,γ-在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO-38中誘導(dǎo)分化作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 了解PPARγ蛋白在人膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，觀察CDA-2對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO-38 PPARγ蛋白表達(dá)的影響和對SWO-38細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，并進(jìn)一步探討PPARγ在膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)分化中的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)分化治療提供治療靶點，同時也為發(fā)展新的分化誘導(dǎo)劑提供靶標(biāo)和科學(xué)依據(jù)。 方法： 1.應(yīng)用免疫組化檢測40例膠質(zhì)瘤組織中PPARγ蛋白表達(dá)；RT-PCR和western blot檢測人膠質(zhì)瘤細(xì)胞S

2、WO-38、U251和SHG-44中PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)；western blot檢測三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)。 2.Western blot檢測羅格列酮、ATRA和CDA-2在不同劑量和不同作用時間對SWO-38細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)的影響；RT-PCR進(jìn)一步了解CDA-2對SWO-38細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)；免疫組化CDA-2對PPARγ蛋白亞細(xì)胞定位的影響。 3.MTT、集落形成實驗檢測

3、CDA-2對SWO-38細(xì)胞活性及增殖能力的影響：FCM進(jìn)一步了解CDA-2對SWO-38細(xì)胞周期的影響；HE染色、免疫組化和western blot從細(xì)胞形態(tài)和GFAP蛋白表達(dá)等方面檢測CDA-2對SWO-38細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。 4.PPARγ抑制劑GW9662預(yù)處理細(xì)胞后，通過MTT、集落形成實驗、FCM和western blot等方法檢測SWO-38細(xì)胞在細(xì)胞活性、增殖能力、細(xì)胞周期和GFAP蛋白表達(dá)等方面的變化，了解C

4、DA-2對SWO-38細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)分化作用與PPARγ之間的關(guān)系。同時，western blot檢測CDA-2誘導(dǎo)SWO-38細(xì)胞分化過程中PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白的表達(dá)； GW9662預(yù)處理細(xì)胞阻斷PPARγ活化，western blot進(jìn)一步檢測SWO-38細(xì)胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白在對照組(DMSO+CDA-2)和抑制劑組(GW9662+CDA-2)的表達(dá)，探討PPARγ在CDA-2誘導(dǎo)S

5、WO-38細(xì)胞分化中的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.PPARγ在膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)率僅為37.5％，在瘤旁腦組織中的陽性表達(dá)率為76.9％，二者間差異有顯著意義(p＜0.05)；PPARγ表達(dá)與膠質(zhì)瘤分化程度無明顯相關(guān)l生(p＞0.05)；PPARγmRNA和蛋白在SWO-38和U251細(xì)胞均有中表達(dá)，而SHG-44細(xì)胞中無表達(dá)；GFAP蛋白在SHG-44細(xì)胞中表達(dá)明顯高于SWO-38和U251細(xì)胞(p＜0.05)。

6、 2.Western blot結(jié)果提示羅格列酮、ATRA和CDA-2均可促進(jìn)SWO-38細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)，CDA-2 3mg/ml作用3h即可明顯促進(jìn)細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)；RT-PCR結(jié)果則表明CDA-2可促進(jìn)SWO-38細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)；免疫組化檢測結(jié)果顯示對照組PPARγ蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，CDA-2處理組PPARγ蛋白主要表達(dá)于胞核，即PPARγ蛋白出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位。 3.MTT和集落形成實驗結(jié)果提

7、示CDA-2抑制SWO-38細(xì)胞活性和增殖能力，中效抑制濃度(IC50)分別為2.33±0.37mg/ml和0.51+0.01mg/ml，其抑制作用呈時間和劑量依賴性增強(qiáng)；細(xì)胞周期檢測提示在CDA-2作用下，G0/G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少，提示G1期阻滯；HE染色結(jié)果顯示CDA-2 3mg/ml作用72h后SWO-38細(xì)胞胞體增大，核/漿比例減小，細(xì)胞突起增多變長；免疫組化和western blot顯示細(xì)胞GFAP蛋白表

8、達(dá)增強(qiáng)，瘤細(xì)胞表現(xiàn)出向成熟膠質(zhì)細(xì)胞分化表型。 4.PPARγ抑制劑GW9662預(yù)處理SWO-38細(xì)胞后，與對照組(DMSO+CDA-2組)相比，MTT結(jié)果顯示抑制劑組CDA-2對細(xì)胞的抑制作用減弱，二者的IC50分別為2.46±0.16mg/ml及1.79±0.18mg/ml(P＜0.05)；集落形成實驗結(jié)果顯示抑制劑組CDA-2對細(xì)胞克隆形成的抑制作用下降(P＜0.05)；FCM顯示抑制劑組S期細(xì)胞增多(P＜0.05)；western

9、 blot結(jié)果提示抑制劑組GFAP蛋白表達(dá)較對照組明顯下降(P＜0.05)，提示CDA-2對SWO-38細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)分化作用與PPARγ有關(guān)。同時，western blot結(jié)果亦表明CDA-2可促進(jìn)SWO-38細(xì)胞PTEN(p-PTEN)蛋白表達(dá)而抑制COX-2蛋白表達(dá)；Western blot進(jìn)一步證實CDA-2對SWO-38細(xì)胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用可部分被GW9662逆轉(zhuǎn)，提示CDA-2對S

10、WO-38細(xì)胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白的調(diào)控作用與PPARy有關(guān)。 結(jié)論： 1.PPARγ與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)，可為膠質(zhì)瘤治療提供新的靶點。2.CDA-2可上調(diào)SWO-38細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，提示CDA-2可活化PPARY蛋白。 3.CDA-2在體外實驗中顯示對SWO-38細(xì)胞的增殖抑制和周期阻滯作用；同時，CDA-2誘導(dǎo)SWO-38細(xì)胞趨于成熟分化，是一種良好的誘導(dǎo)分化劑。