CUL4B在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均較高，其起源于成熟的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞，呈“樹(shù)根樣”廣泛的浸潤(rùn)到周圍組織，導(dǎo)致手術(shù)難以徹底的切除，而且有極高的復(fù)發(fā)率。病人的存活率取決于腫瘤的類型及腫瘤的惡性程度，根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤的惡性程度分為四個(gè)等級(jí)(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)。其中，Ⅳ型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的致死率最高，5年存活率低于10％，其原因在于手術(shù)全切除的難度極大，瘤細(xì)胞對(duì)放化療均不敏感。因此，在現(xiàn)代神經(jīng)

2、外科學(xué)界針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療策略還存在巨大的挑戰(zhàn)。早在20世紀(jì)，科學(xué)家就提出膠質(zhì)瘤是一種分子方面存在缺陷的遺傳病，并且推測(cè)可以通過(guò)分子治療手段來(lái)克服這一難題。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤的分子靶向治療已經(jīng)引起人們的關(guān)注。 Cullin4B(CUL4B)是Cullin4B-Ring E3 ligase complex(CRL4B)的組成成分之一。Cullin4B以CRL4B的形式參與到蛋白質(zhì)的泛素化進(jìn)程當(dāng)中，CRL4B在泛素-蛋白酶途徑中特異性識(shí)別底物，泛

3、素化過(guò)程在真核生物體內(nèi)是信使RNA被轉(zhuǎn)譯成蛋白后的重要修飾之一，在體內(nèi)，蛋白在酶的催化下被泛素化，然后進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解。泛素化進(jìn)程在蛋白質(zhì)合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用，參與到機(jī)體的細(xì)胞周期，生長(zhǎng)發(fā)育和生殖等生理活動(dòng)中。并且大量的研究報(bào)道提示CUL4B在DNA甲基化、蛋白分解以及腫瘤發(fā)生機(jī)制中起著重要的作用。而且相關(guān)研究提示我們Cullin4B在腦部的發(fā)育中承擔(dān)著重要角色。但有關(guān)CUL4B在人體腦部腫瘤中作用的相關(guān)研究較少，

4、包括膠質(zhì)瘤。所以我們將CUL4B在膠質(zhì)瘤中的角色及其相關(guān)作用分子進(jìn)行了初步探討，希望能發(fā)現(xiàn)治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤靶向治療的提供一項(xiàng)新策略。
　　本研究首先表征了CUL4B在膠質(zhì)瘤病變部分以及癌旁周圍腦組織中的表水平情況，然后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞株，并用RNA干擾技術(shù)(RNAi)成功建立CUL4B的內(nèi)源性表達(dá)降低的膠質(zhì)瘤母細(xì)胞模型，用western blot技術(shù)檢測(cè)慢病毒是否成功轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U8

5、7和U251，致CUL4B表達(dá)水平降低。除此之外，通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫染色的方法完成了關(guān)于CUL4B對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞集落形成的研究;用流式細(xì)胞技術(shù)監(jiān)測(cè)到CUL4B對(duì)U87、U251細(xì)胞周期產(chǎn)生的變化;用Transwell檢測(cè)方法觀察到CUL4B對(duì)U87、U251細(xì)胞的細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)也起到一定作用;在體內(nèi)試驗(yàn)中，通過(guò)接種shRNA感染的U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，模擬CUL4B對(duì)體內(nèi)腫瘤形成的影響，在功能上探究了CUL4B在膠

6、質(zhì)瘤中的作用.本文同時(shí)也研究了下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控因子的影響。
　　實(shí)驗(yàn)一CUL4B在膠質(zhì)瘤組織與周圍腦組織中的表達(dá)情況
　　1.1 CUL4B在膠質(zhì)瘤中及周圍腦組織中的表達(dá)
　　首先，實(shí)驗(yàn)用qPCR的方法測(cè)定了15組膠質(zhì)瘤及周圍腦組織中CUL4B的表達(dá)，與同組周圍正常的腦組織相比，14組的膠質(zhì)瘤病變組織中CUL4B mRNA的表達(dá)升高了了3倍以上。該結(jié)果表明CUL4B在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，可能

7、與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)二CUL4B在膠質(zhì)瘤中的作用研究
　　2.1通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CUL4B表達(dá)
　　U87和U251細(xì)胞分別感染表達(dá)shRNA的慢病毒(Lv-shCon和Lv-shCUL4B)，4天后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)水平變化。Lv-shCon組和Lv-shCUL4B組中，80％的細(xì)胞表達(dá)GFP，表明細(xì)胞株中慢病毒感染成功。qPCR和western blotting

8、結(jié)果顯示Lv-shCUL4B中內(nèi)源性CUL4B表達(dá)受到抑制。與未感染對(duì)照組相比，Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞的CUL4B mRNA水平顯著下降，約77.4％，U251細(xì)胞中下降了77.8％，而在Lv-shCon和Con組間在CUL4B mRNA表達(dá)水平上沒(méi)有出現(xiàn)差別，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫印跡實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)兩種細(xì)胞株中CUL4B mRNA的下調(diào)同樣表現(xiàn)在蛋白水平上。因此，慢病毒包裝的shRNA可顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中內(nèi)源性CUL4B的表

9、達(dá)。
　　2.2下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成的影響
　　慢病毒感染U87和U251細(xì)胞，通過(guò)CCK-8的檢測(cè)評(píng)價(jià)CUL4B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示:第5天，與對(duì)照組相比，Lv-shCUL4B細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，U87細(xì)胞降低了63.7％，U251細(xì)胞降低了45.5％，上述結(jié)果提示降低CUL4B的表達(dá)可顯著抑制兩種細(xì)胞U87、U251的生長(zhǎng)過(guò)程。
　　慢病毒感染后，U87、U251細(xì)胞可見(jiàn)集落形

10、成（結(jié)晶紫染色），U87細(xì)胞，對(duì)照組和Lv-shCon組細(xì)胞集落數(shù)量均值高達(dá)150，而在Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到30。與此同時(shí)，U251細(xì)胞，對(duì)照組和Lv-shCon組細(xì)胞集落均數(shù)為200，而Lv-shCUL4B組集落均數(shù)不到40。這些結(jié)果均顯示下調(diào)CUL4B的表達(dá)可顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87、U251)細(xì)胞集落的形成過(guò)程。
　　2.3下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響
　　通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)得到的結(jié)果觀

11、察U87、U251兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期排布，初步探索CUL4B調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)處于細(xì)胞周期G1期的U87細(xì)胞，Con對(duì)照組約為50.0％，Lv-shCon對(duì)照組約為52.0％，而在Lv-shCUL4B組升高至約82.0％。相反，與Lv-shCon組相比， Lv-shCUL4B組處于S期的U87細(xì)胞明顯減少，Con對(duì)照組、Lv-shCon對(duì)照組和Lv-shCUL4B組分別為40.0％、38.0％、10％。與之類似，由于下調(diào)CUL4B

12、的表達(dá)，處于G1期的U251細(xì)胞比例上升，處于S期的比例下降。結(jié)果顯示下調(diào)CUL4B的表達(dá)可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞在G1期停滯從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　2.4下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響
　　Tmnswell檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)U87、U251兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以發(fā)生遷移運(yùn)動(dòng)，Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞發(fā)生遷移的細(xì)胞平均數(shù)為65，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于空白組和Lv-shCon的平均數(shù)值，分別為224、210(p＜0.01)。下調(diào)CUL

13、4B的表達(dá)后，U251細(xì)胞發(fā)生遷移的數(shù)量亦明顯減少(p＜0.01)，結(jié)果顯示，通過(guò)下調(diào)CUL4B的表達(dá)可阻礙神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移。
　　2.5下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下腫瘤形成的影響
　　通過(guò)接種慢病毒感染的U87、U251細(xì)胞，裸鼠種植異體人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模擬膠質(zhì)瘤的模型成功，隨著種植細(xì)胞瘤的時(shí)間發(fā)展，各組皮下腫瘤形狀慢慢增大，然而與Lv-shCon組對(duì)比，Lv-shCUL4B組腫瘤增長(zhǎng)速率明顯降低。與

14、Lv-shCon組相比，Lv-shCUL4B組U87細(xì)胞種植裸鼠腫瘤重量降低57.7％，U251細(xì)胞種植裸鼠腫瘤重量下降75.4％(p＜0.01)，上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，下調(diào)CUL4B的表達(dá)可有效的抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。
　　2.6下調(diào)CUL4B表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的調(diào)控因子的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和Lv-shCon組相比，Lv-shCUL4B組Cyclin D1和MMP-

15、9表達(dá)水平下降，p16(INK4A)和PTEN表達(dá)水平升高。結(jié)果顯示，CUL4B可能是通過(guò)調(diào)節(jié)上述調(diào)控蛋白表達(dá)量的方式對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝起到重要作用。
　　本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中CUL4B呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，研究顯示CUL4B參與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功建立CULB4的內(nèi)源性表達(dá)降低細(xì)胞模型，探究CUL4B與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，集落形成，細(xì)胞周期及皮下腫瘤形成的關(guān)系，研究顯示CUL4B

16、參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖，形成及細(xì)胞周期等過(guò)程中。結(jié)果顯示通過(guò)表達(dá)shRNA的慢病毒下調(diào)CUL4B的表達(dá)，可顯著抑制細(xì)胞增生及細(xì)胞集落的形成，上述兩種細(xì)胞系中Cyclin D1表達(dá)下調(diào)， p16表達(dá)上調(diào)從而使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，與此同時(shí)，腫瘤抑制因子PTEN的表達(dá)增加。進(jìn)一步通過(guò)膠質(zhì)瘤種植裸鼠模型發(fā)現(xiàn)，CUL4B的丟失可減輕體內(nèi)腫瘤的形成，而且下調(diào)CUL4B的表達(dá)可抑制MMP-9的表達(dá)，從而阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此下調(diào)CUL4B的表